基于线粒体16S rRNA基因的14种造礁石珊瑚系统发育关系分析

廖宝林，肖宝华，2，杨小东，谢子强

（1.广东海洋大学深圳研究院，广东 深圳 518108，2.广东海洋大学，广东 湛江 524025，3.深圳市碧海蓝天海洋科技有限公司，广东　深圳 518108）

基于线粒体16S rRNA基因的14种造礁石珊瑚系统发育关系分析

廖宝林1，肖宝华1，2，杨小东1，谢子强3

（1.广东海洋大学深圳研究院，广东 深圳 518108，2.广东海洋大学，广东 湛江 524025，3.深圳市碧海蓝天海洋科技有限公司，广东深圳 518108）

通过16S rRNA基因特异扩增测序，对惠州大亚湾大辣甲岛和小辣甲岛附近海域14种造礁石珊瑚16S rRNA基因片段序列进行了比较分析。结果表明，该片段序列的平均 A+T含量为 63.5%，所有物种的序列碱基AT含量大于GC含量，序列都处于高度饱和的状态。14种造礁石珊瑚的平均遗传距离为0.179。采用NJ、ML和ME法构建系统发育树，结果显示蜂巢珊瑚科单独作为分支处于发育树的基部，而第二支分支包括菌珊瑚科、鹿角珊瑚科、滨珊瑚科和枇杷珊瑚科。裸肋珊瑚科的腐蚀刺柄珊瑚聚到了蜂巢珊瑚科中，与传统形态学分类存在差异，提示造礁石珊瑚表型的变异性可能对传统分类存在影响。

造礁石珊瑚； 16S rRNA；分子系统学

造礁石珊瑚属于刺胞动物门（Cnidaria）珊瑚纲（Anthozoa）六射珊瑚亚目（Hexocorallia）石珊瑚目（Scleractinia），主要分布于地球赤道南北纬30°以内的海域［1］。由造礁石珊瑚组成的珊瑚礁生态系统是世界上第二大生态系统。过去造礁石珊瑚的分类主要通过其骨骼结构作为标准。近30年来，通过分子生物学手段对造礁石珊瑚亲缘关系鉴定已进行了广泛的研究，随着研究的深入，很多结果都与传统形态学鉴定结果存在一定的差异［2-3］，显示了全面研究造礁石珊瑚分类的必要性。

大辣甲岛和小辣甲岛位于大亚湾海域西侧，岛屿沿岸水深5m以内的基岩石上均有珊瑚群落分布［4］。早在20世纪80年代，就有学者对大、小辣甲岛屿附近珊瑚分布进行初步的调查［5］，调查结果显示大、小辣甲岛屿附近海域珊瑚礁覆盖率达到78.1%和72.7%，霜鹿角珊瑚为这两个地区的优势品种。2000年以后，陈天然等［6-7］对大亚湾石珊瑚群落的分布及动态变化进行调查，调查结果显示大、小辣甲的活珊瑚覆盖率有明显下降的趋势，优势品种也从原有的分支状的鹿角珊瑚转变成团块状的角蜂巢珊瑚。近几年来，广东珊瑚礁普查都在大、小辣甲岛进行调查，数据显示大辣甲的覆盖率仅在25%左右，而小辣甲的覆盖率更低，仅为15%左右，大亚湾造礁石珊瑚退化情况十分严重。

16S rRNA基因具有线粒体基因的母系遗传、变化速率快、高度保守性的共同特征，同时该基因还具有种间差异明显而种群内个体间变异小的特点，被认为是科以下水平物种间亲缘关系和系统演化研究的有效标记［8-9］，在水螅虫纲（Hydrozoa）、对虾属（Penaeus）、珠母贝属（Pinctada）等无脊椎动物中得到了广泛应用［10-12］。1996年Romano等［13］在世界上首次使用16S rRNA基因作为分子标记对34种造礁石珊瑚的系统进化关系进行研究，此后国内外都有应用16S rRNA基因对造礁石珊瑚系统进化和遗传多样性进行研究的报道［14-17］。这些分子研究结果与传统形态学系统进化结果出现差异，传统形态学结果存在受珊瑚骨骼生长变异性限制的可能性。

本研究通过聚合酶链式反应技术（PCR），利用线粒体16S rRNA基因的部分序列片段作为分子标记，对大、小辣甲海域的14种造礁石珊瑚的系统进化关系进行研究，为该地区造礁石珊瑚资源保护提供理论基础。

1　材料与方法

1.1样品采集和形态学鉴定

本研究的造礁石珊瑚样品采自广东省惠州市大亚湾地区的大辣甲岛及小辣甲岛附近海域，形态学鉴定依照文献 ［1］和［18］，将采集的样品可分为6科10属14种，样品形态学鉴定结果见表1。样品截取一小段保存于无水乙醇中以备后续DNA提取实验使用。

表1　珊瑚样品Tab.1　Coral samples

1.2基因组总DNA的提取

使用北京天根生物有限公司生产的海洋动物组织基因组提取试剂盒行提取珊瑚样品的DNA，所提取的DNA置于4℃保存备用。

1.3引物设计合成

16S rRNA基因的PCR引物均参考Forsman等［14］的研究报道。引物由上海生工生物技术服务有限公司合成，引物信息见表2。

表2　16S rRNA基因的PCR引物Tab.2　List of PCR primers for 16S rRNA

1.3PCR扩增和DNA测序

PCR反应体系反应总体积25 µL：10 × Buffer 2.5 µL，dNTP 2 µL，上下游引物各1 µL，Taq DNA聚合酶1 U及DNA模板2 µL；其余用去离子水补至25 µL。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性45 s，50℃退火45 s，72℃延伸1min 30 s，共35个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物在10 mg/mL的琼脂糖凝胶中检测，凝胶成像仪拍照记录。选取扩增条带单一、浓度较高的PCR产物送至上海生工生物技术公司进行测序，获取各基因片段的序列信息。

1.4序列分析及系统进化树的构建

测序所得序列用DNASTAR中的Editseq软件进行编辑、剪切、校正，再将校正好的序列与NCBI的数据库进行比对，确认样品的分子结果。采用MEGA6.0软件进行基因序列分析，统计出16S rRNA基因组序列长度、碱基组成、简约信息位点等相关信息。同时根据简约信息位点，计算出种间遗传距离。本研究3种16S rRNA的系统进化树使用MEGA6.0软件基于Kimu-ra双参数模型（ Kimura 2-parameter，K2P），只计算颠换（Transversional substitutions only），采 用 邻位 连 接 法（Neighbor-Joinning，NJ）和 最 小 进 化 法（Minimum-Evolution，ME）构建出来。两种系统进化树中节点的自举置信度水平由自引导值（ Bootstrap value） 估计，重复次数为1 000。

2　结果与分析

2.1造礁石珊瑚16S rRNA基因碱基组成分析

本研究的14个造礁石珊瑚品种的16S rRNA基因部分序列长度在474～630 bp之间。从14个造礁石珊瑚品种的16S rRNA基因部分序列的碱基组成比例来看，全部序列碱基AT含量大于GC含量，与目前已知的无脊椎动物mtDNA序列中AT含量大于GC含量的情况相同。16S rRNA片段碱基中的A、T、C、G含量相差较大，序列基因都处于高度饱和状态。碱基组成信息见表3。

表3　14种造礁石珊瑚16S rRNA基因片段的碱基组成比例Tab.3　The nucleotide Percentage composition of the 16S rRNA fragments

2.2造礁石珊瑚16S rRNA基因序列变化情况

基于Kimura 2-parameter模式的最大似然法计算14种造礁石珊瑚16S rRNA基因部分序列的转换颠换比值R为1.42，序列碱基突变未达到饱和。使用DAMEB软件对15种石珊瑚的16S rRNA序列进行碱基替换饱和分析（图1），当种间遗传距离超过0.42时，碱基转换（Ts）趋于饱和，碱基颠换（Tv）开始超过转换（Ts）。

图1　14种造礁石珊瑚16S rRNA基因碱基替换饱和分析Fig 1　Substitution saturation in the 16S rRNA gene of the 14 species of Scleractinian

2.314种造礁石珊瑚种间遗传距离

通过MEGA6.0计算14种造礁石珊瑚的种间遗传距离，结果显示14种造礁石珊瑚的平均遗传距离为0.179。其中稀环盔形珊瑚（Galaxea astreata）和向日葵蜂巢珊瑚（Favia helianthoides）的种间遗传距离最大，为0.447，而鹿角珊瑚科的霜鹿角珊瑚（Acropora pruinosa）和板叶鹿角珊瑚（Acropora glauca）、滨珊瑚科的大角孔珊瑚（Goniopora djiboutiensis）和滨珊瑚sp.（Porites sp.）的遗传距离最小，为0.000。种间遗传距离信息见表4。

表4　基于16S rRNA的14种造礁石珊瑚种间遗传距离Tab.4　The Pairwise Tamura-Nei genetic distances of nucleotide sequences based on 16S rRNA among the species of Scleractinian

2.4基于16S rRNA对14种造礁石珊瑚的的系统进化分析

以多管水母科（Aequoreidae）的锥形多管水母（Aequorea conica）作为外源种（GenBank序列号：JQ715990.1），采用邻位连接法（Neighbor-Joinning，NJ）、最大似然法（Minimum-Likelihood，ML）和最小进化法（Minimum-Evolution，ME）构建14种造礁石珊瑚的16S rRNA分子系统树（图2～4），结果显示三种方法构建的系统进化树拓扑结构完全一致，蜂巢珊瑚科（Faviidae）单独作为分支处于发育树的基部，而第二支分支包括菌珊瑚科（Agaricidae）、鹿角珊瑚科（Acroporidae）、滨珊瑚科（Portidae）和枇杷珊瑚科（Oculinidae）。各科的珊瑚品种各聚为一枝，但出现了裸肋珊瑚科（Merulinidae）的腐蚀刺柄珊瑚（H.exesa）与秘密角蜂巢珊瑚（F.abidita）聚为一枝的现象。

图2　利用16S rRNA序列数据构建的分子系统进化NJ树Fig.2　The Neighbor-Joining tree constructed with 16S RNA gene sequence

图3　利用16S rRNA序列数据构建的分子系统进化ML树Fig.3　The Minimum-Likelihood tree constructed with 16S RNA gene sequence

图4　利用16S rRNA序列数据构建的分子系统进化ME树Fig.4　The Minimum-Evolution tree constructed with 16S RNA gene sequence

3　讨论

3.114种造礁石珊瑚16S rRNA基因序列特点

线粒体16S核糖体RNA基因相较其他造礁石珊瑚的线粒体基因进化速率较慢，且较为保守，常用于种以上分子分类的标记［19］。本研究的 14个造礁石珊瑚品种的 16S rRNA基因部分序列长度在474～630 bp之间。Romano等［15］对20科61属68种造礁石珊瑚的16S rRNA片段序列进行碱基组成比较，片段长度在407～566 bp之间。李晓娜［20］使用与本研究相同的引物对广东徐闻 18种造礁石珊瑚的 16S rRNA片段序列进行比较，序列长度在503～688 bp之间。而Forsman等［14］同样使用与本研究相同的引物，对夏威夷的 7种蔷薇珊瑚属（Montipora）珊瑚16S rRNA片段序列进行测序，片段序列长度均为790 bp。16S rRNA基因在造礁石珊瑚属以上的分类阶元中种间片段长度具有较大的差异，而属内差异片段长度差异不大。从序列的碱基组成、序列变化和遗传距离上看，16S rRNA基因十分适宜作为科、属之间的分子分类标记。Romano等［13］发现造礁石珊瑚16s rRNA基因片段的多样性较低于其他后口动物，16S rRNA 基因尽管可以用于属之间的分类，但是由于多样性的不高，不适合作为属内亲缘关系较近的种间分类标记。本研究中鹿角珊瑚属和滨珊瑚科的4种珊瑚的确存在序列完全相似的情况，但也有可能是使用的16S rRNA片段长度较短和样品采集数量较少造成。本研究结果支持16S rRNA作为科一级分类阶元的分子标记，而其是否适宜作为属以下更具体的分类阶元的分子标记，仍需要更多的造礁石珊瑚种类的16S rRNA数据进行验证。

3.2造礁石珊瑚系统分析

早在20世纪90年代，Romano等［13］就首次应用16S rRNA对34种造礁石珊瑚的系统进化关系进行研究，并推断全球范围内现存的造礁石珊瑚在200万年前分化为两大类群，并将这两大类群命名为坚实型类群（Robust）和复合型类群（Complex）。结合已有的形态学研究，Romano认为坚实型珊瑚骨骼钙化程度较高，具有坚实的骨骼结构，珊瑚外观主要以碟片状和团块状为主，其代表种类包括蜂巢珊瑚科（Faviidae）、石芝珊瑚科（Fungiidae）、褶叶珊瑚科（Lobophyllidae）等。复合型珊瑚骨骼钙化程度较低，具有较为复杂多变的生长形态，其代表种类包括鹿角珊瑚科（Acroporidae）、菌珊瑚科（Agaricidae）、木珊瑚科（Dendrophlliidae）、滨珊瑚科（Portidae）等。经过近20 a的造礁石珊瑚分子系统学研究发展，国内外的许多学者积累的分子数据都极力地支持了这一学说。Fukami等［21］使用多种分子标记对17科75属127种造礁石珊瑚进行了系统进化分析，在坚实型和复合型两大分支的基础上将造礁石珊瑚细分成21个分类群，其中9个分支类群属于复合型珊瑚，12个分支类群属于坚实型珊瑚。本研究采用邻位连接法（NJ）、最大似然法（ML）和最小进化法（ME）对14种造礁石珊瑚16S rRNA基因片段构建了系统发育树，聚类结果符合两大类群学说的系统进化结果。滨珊瑚科、菌珊瑚科、枇杷珊瑚科和鹿角珊瑚科的品种聚为一大类，即为复合型类群。蜂巢珊瑚和裸肋珊瑚科的品种聚为另一类，即为坚实型类群。

相对来说，复合型珊瑚类群的分子系统进化关系与传统分类学的系统关系较为一致。而坚实型珊瑚类群的分子系统进化关系则与传统分类学存在很多不一致的地方，部分科属之间关系较为混乱。Huang等［22］根据Fukami划分的21个造礁石珊瑚分支类群进行研究，发现属于坚实型的第17个分支类群最为混乱，里面包含了的4个科：蜂巢珊瑚科（Faviidae）、裸肋珊瑚科（Merulinidae）、梳状珊瑚科（Pectiniidae）、脑珊瑚科（Trachyphylliidae）。这个类群在分子系统进化关系上存在相互并系现象，不同科属之间的物种重新聚为新的分支。本研究从科一级聚类结果看，16S rRNA基因构建的系统进化关系与传统形态学的构建的系统进化关系基本一致，各科的造礁石珊瑚品种都各自聚为一支，但裸肋珊瑚科的腐蚀刺柄珊瑚的系统进化关系却与传统形态学存在一定的差异，聚类结果显示腐蚀刺柄珊瑚聚到了蜂巢珊瑚科中并且与角蜂巢珊瑚关系最为接近。许多学者利用不同分子标记对蜂巢珊瑚科和裸肋珊瑚科的珊瑚品种进行系统进化分析，都得到了与本研究相类似的聚类结果［13，21～23］。近年来在骨骼研究方面，我国台湾学者戴昌凤等［24］通过共骨结构对比同样认为刺柄珊瑚属也应归属于蜂巢珊瑚科。因此，传统分类对于刺柄珊瑚属的归类于裸肋珊瑚科的论断值得商榷，本研究结果支持刺柄珊瑚属归属于蜂巢珊瑚科。

蜂巢珊瑚科是造礁石珊瑚中种类第二丰富的一个类群，近年来许多学者通过分子系统进化研究的结果都显示蜂巢珊瑚科的多重起源造成了不同属间复杂的亲缘关系［21-23］。本研究中，同为角蜂巢珊瑚属的秘密角蜂巢珊瑚（Favites.abidita）、小五边角蜂巢珊瑚（Favites.micropentagona）和角蜂巢珊瑚sp（Favites.sp）都聚为一支，但五边角蜂巢（Favites.pentagona）先与扁脑珊瑚属（Platygyra）的肉质扁脑珊瑚（Platygyra.carnosus）聚为一支，再与角蜂巢珊瑚属聚到一起。这与传统形态学系统分类存在一定的差异。Huang等［25］在对新加坡附近海域的蜂巢珊瑚科珊瑚系统进化关系研究的过程中发现蜂巢珊瑚科的并系现象普遍存在，形态学分类为同一属的品种往往是不同祖先的蜂巢珊瑚趋同进化的结果。Arrigoni等［23］采用COI作为分子标记对印度洋海域的蜂巢珊瑚科的珊瑚品种进行系统进化分析，结果同样显示五边角蜂巢珊瑚与扁脑珊瑚属关系更近，而与其他几种角蜂巢珊瑚关系更远。从本研究结果来看，五边角蜂巢珊瑚和肉质扁脑珊瑚可能具有更近一个共同祖先。

近年来，许多学者通过显微扫描技术对造礁石珊瑚骨骼的精细结构进行观察，对20世纪Veron［18］经典的传统形态学研究结果进行了校正和补充［26-27］。新的造礁石珊瑚骨骼研究正逐渐改变对造礁石珊瑚传统分类的看法，同时也对分子系统进化研究结果提供了有力的佐证。在当今的造礁石珊瑚系统进化研究中，无论是传统的形态学方法还是利用分子技术手段，两者都必须相互借鉴和补充。

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（责任编辑：陈庄）

Phylogenetic Analysis for 14 Species of Reef-building Corals Based on 16S rRNA genes

LIAO Bao-Lin1，XIAO Bao-hua1，2，YANG Xiao-Dong1，XIE Zi-Qiang3
（1.Shenzhen Research Institute of Guangdong Ocean University，Shenzhen 518108，China；2.Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524025，China；3.Shenzhen Ocean Hyaline Marine Science and Technology Co，Ltd.Shenzhen 518108，China）

Partial sequences of 16S rRNA from 14 species of reef-building corals in Dalajia Island and Xiaolajia Island were amplified and sequenced，and Base ratio and genetic distances were analyzed.The result indicated that the average A+T of this region accounted for 63.5% from 14 species； A+T contents of 16S rRNA fragments were higher than G+C obviously.The sequences of 16S rRNA fragments had a high degree of saturation.The average genetic distance was 0.179 from 14 species.According to the Neighbour-joining，Maximum-likelihood and Minimum-evolution trees，the separated Faviidae was the root clade，and the second clade was composed of Agariciidae，Acroporidae，Poritidae and Oculinidae.The Hydnophora exesa of Merulinidae merged into the Faviidae.The result suggested that morphological classification may be limited by coral skeletons plasticity.

Reef-building corals； 16SRNA； Molecular phylogenetics

S917.4

A

1673-9159（2016）04-0023-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.04.005

2016-05-13

广东省公益研究与能力建设专项 （K15216）；广东省海洋渔业科技推广专项（A201308E02）

廖宝林（1984—），男，硕士，工程师，主要从事海洋生态学研究。 E-mail：13590010881@163.com

肖宝华（1978—），男，助理研究员，硕士，主要从事水产养殖及海洋生态学研究。电话：0759-2396216，E-mail：gdouxxhpaper@126.com