桥本氏甲状腺炎患者外周血中CD4+CD45RO+记忆性T细胞的表达及意义

马倩倩　梁秋华　孙　琳　张正军　于世鹏

(济宁医学院，济宁272067)



桥本氏甲状腺炎患者外周血中CD4+CD45RO+记忆性T细胞的表达及意义

马倩倩梁秋华孙琳张正军于世鹏①

(济宁医学院，济宁272067)

目的：检测初诊桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis,HT)患者外周血CD4+CD45RO+记忆性T细胞比例，探讨其在HT发病中的意义。方法：收集初诊的HT患者作为病例组(HT,n=53)，另外选取年龄、性别相匹配的正常人作为对照组(HC,n=43)，并根据甲状腺功能状态将HT组分为甲状腺功能正常组(HT-A,n=15)、亚临床甲减组(HT-B,n=14)和临床甲减组(HT-C,n=24)。流式细胞仪检测外周静脉血中CD4+CD45RO+记忆性T细胞比例，酶联免疫吸附法检测血清中IFN-γ、IL-17水平，化学发光法检测甲状腺功能及甲状腺特异性抗体滴度。结果：HT组外周血中CD4+CD45RO+记忆性T细胞比例、IFN-γ、IL-17、TPOAb与TgAb水平均显著高于HC组，P<0.01。双变量相关分析显示HT患者外周血CD4+CD45RO+记忆性T细胞的比例与IFN-γ、TPOAb、TgAb均呈正相关(P<0.01，P=0.015，P<0.01)。结论：CD4+CD45RO+记忆性T细胞在HT患者外周血中呈高表达，CD4+CD45RO+记忆性T细胞可能参与了HT的发病过程。

桥本氏甲状腺炎;记忆性细胞;CD4+CD45RO+

桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis,HT)是典型的T细胞介导的器官特异性自身免疫性甲状腺疾病[1]。在HT中，正常的甲状腺腺体被淋巴细胞弥漫性浸润，甲状腺滤泡破坏并甲状腺组织逐渐萎缩，伴有血清中甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)及甲状腺球蛋白抗体(TgAb)等甲状腺特异性抗体升高。

一般认为，遗传和环境因素之间相互作用引起的机体免疫耐受的打破和自身反应性T细胞的激活是HT发病的关键，然而，其具体发生机制仍不明确。记忆性T细胞是初始T细胞在外周淋巴器官内接受抗原提呈细胞提呈的抗原后活化直接分化而成或由效应T细胞转化而来。研究证实，记忆性T细胞与自身反应性T细胞可以相互转化并参与了包括多发性硬化、系统性红斑狼疮等多种自身免疫性疾病的发生[1-4]，但其与HT的发病是否有关，尚无相关报道。本研究通过检测HT患者与正常人外周血CD4+CD45RO+记忆性T细胞、IFN-γ、IL-17、TPOAb及TgAb的表达水平及其之间的相关性，旨在探究CD4+CD45RO+记忆性T细胞与HT发病的相关性，为研究HT的发病机制提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象2015年1月1日～2016年2月1日期间就诊于济宁医学院附属医院的初诊HT患者53名(女性51例，男性2例)，年龄(38.81±15.80)岁，且无确诊的自身免疫性疾病、未服用过影响甲状腺功能的药物、未使用免疫抑制剂和糖皮质激素类药物，排除各种原因引起的急慢性炎症。选取43例 (女性42例，男性1例)、年龄(37.40±9.65岁)、性别与HT组相匹配的于济宁医学院附属医院体检或者咨询的正常人作为对照组。根据甲状腺功能状态将HT患者组分为甲状腺功能正常 (HT-A，女性15例，男性1例)、亚临床甲减组 (HT-B，女性14例，男性0例)和临床甲减组 (HT-C，女性23例，男性1例)3个亚组。本研究获得济宁医学院附属医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署书面知情同意书。HT的诊断基于《内科学》第8版(人民卫生出版社)中HT的诊断标准[5]。

1.1.2主要仪器和试剂流式细胞仪型号为美国BD公司的FACS Calibur；FITC标记大鼠抗人CD4 IgG2a、PE标记大鼠抗人CD45RO IgG2b及其同型对照均购自美国e-Bioscience公司。IL-17细胞因子和IFN-γ细胞因子试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；酶标仪购自ThermoLabsystems公司。免疫分析仪型号为德国罗氏公司的Cobas6000。

1.2方法

1.2.1标本收集清晨空腹条件下抽取研究对象外周血2 ml×2管，其中1管送至检验科检测甲状腺功能状态及甲状腺相关特异性抗体，另1管1 000 r/min离心10 min后取上层血浆保存于-80℃冰箱，用于细胞因子的ELISA检测，收集下层血细胞用于CD4+CD45RO+记忆性T细胞流式检测。标本处理时间在采血后4 h以内完成。

1.2.2甲功及甲状腺抗体的测定甲状腺功能及甲状腺特异性抗体均由济宁医学院附属医院检验科按照标准化流程应用化学发光法检测。正常范围如下:FT3(3.10～6.80 pmol/L)、FT4(12.0～22.0 pmol/L)、TSH(0.274～4.20 mU/L)、TPOAb(0～34 U/ml)、TgAb(0～110 U/ml)。

1.2.3流式细胞测定取50 ml全血应用流式细胞仪检测CD4+CD45RO+记忆性T细胞。步骤如下:①对应标本编号进行试管编号，并按要求每一试管加入对应抗体及标本，涡旋混匀，避光孵育15 min；②加溶血素1.5 ml，涡旋混匀，避光孵育10 min，1 300 r/min离心5 min后去上清；③加PBS 1.5 ml涡旋混匀，1 300 r/min离心5 min后去上清，加PBS 0.5 ml，涡旋混匀；④上流式细胞仪检测，用Cells Quest软件获取数据并进行分析。

1.2.4酶联免疫吸附测定应用ELISA测定血清IFN-γ、IL-17水平，步骤如下:①确定所需抗体包被酶标板孔数目，增加2孔作为TMB空白显色孔，将不同浓度标准品及已用样品稀释液稀释的样品100 μl加入，加封板膜，37℃反应90 min后洗涤；②每孔加入100 μl生物素抗人抗体工作液，加封板膜，37℃反应60 min后用洗涤；③每孔加入100 μl亲和素-过氧化物酶抗体工作液(TMB空白显色孔除外)，加封板膜，37℃反应30 min后洗涤；④每孔加入TMB显色液90 μl，37℃避光反应30 min后观察每孔颜色变为蓝色的情况；⑤每孔加入TMB终止液100 ml，蓝色变为黄色；⑥用酶标仪测定OD值；⑦将TMB空白显色孔设为对照，做出曲线图，找出各样品对应浓度；⑧分析。

2　结果

2.1甲状腺指标比较HT组血清TSH浓度、TPOAb与TgAb滴度均显著高于HC组(P<0.01,P<0.01,P<0.01)，HT组血清FT4浓度显著低于HC组(P<0.01)，血清FT3浓度与HC组无显著差异(P=0.281)。见表1。

2.2外周血中CD4+CD45RO+记忆性T细胞比例HT组外周血CD4+CD45RO+记忆性T细胞比例(29.31±5.79)较HC组(21.03±3.06)显著升高(P<0.01)，HT-A组(25.07±4.34)、HT-B组(30.09±3.80)和HT-C组(31.08±5.84)CD4+CD45RO+记忆性T细胞比例均显著高于HC组(P=0.030,P<0.01,P<0.01)，HT-C组CD4+CD45RO+记忆性T细胞比例均显著高于HT-A组(P=0.012)。见图1、表2。

表1病例组与对照组的临床资料

Tab.1Clinical information of patients with Hashimoto′s thyroiditis(HT) and healthy controls(HC)

ItermsCases(n)Gender(F/M)FT3(pmol/L)FT4(pmol/L)TSH(mU/L)TPOAb(U/ml)TgAb(U/ml)HT5351/24.57(3.60-5.10)11.66(8.45-13.931)8.64(2.76-38.64)1)449.80(325.30-600)1)466.70(298.20-1350.00)1)HT-A1515/14.79(4.16-5.29)14.20(13.30-17.35)2.08(1.20-2.60)378.90(266.95-600.00)1)368.90(292.45-540.65)1)HT-B1414/04.58(3.93-5.06)13.54(12.40-15.24)1)7.76(6.01-9.80)1)2)449.80(148.50-553.95)1)605.70(524.20-2919.50)1)2)HT-C2423/14.41(2.30-4.96)9.04(3.23-10.87)1)2)3)30.92(9.47-100.00)1)2)3)490.30(338.20-600.00)1)465.10(199.40-1968.00)1)HC4342/14.72(4.21-5.07)15.98(14.71-17.27)1.83(1.52-2.13)7.92(5.06-11.50)24.52(16.85-28.05)NR--3.10-6.8012.0-22.00.274-4.200-340-110

Note：vs HC,1)P<0.05;vs HT-A,2)P<0.05;vs HT-B,3)P<0.05；HT.Hashimoto′s Thyroiditis;HT-A.Euthyroid subset of Hashimoto′s thyroiditis;HT-B.Subclinical hypothyroidism of Hashimoto′s Thyroiditis;HT-C.Overt hypothyroidism subset of Hashimoto′s Thyroiditis;HC.Healthy control;FT3.Free triiodothyronine;FT4.Free thyroxine;THS.Thyroid-stimulating hormone;TPOAb.Thyroid peroxidaseantibody;TgAb.Thyroglobulin antibody;NR.Normal range.

图1　CD4+CD45RO+记忆性T细胞流式细胞仪散点图和箱式图Fig.1　Scatter plots and box plots of flow cytometric analysis of CD4+CD45RO+memory T cellsNote: Percentages of CD4+CD45RO+memory T cells in PBMCs,was significantly higher than that in HC(P<0.01),percentages of CD4+CD45RO+memory T cells in PBMCs in HT-A,HT-B,HT-C,were all significantly higher than that in HC(P=0.030,P<0.01,P<0.01).

2.3血清中细胞因子水平ELISA结果HT组血清IFN-γ水平 (282.4±74.42)较HC组(188.46±38.08)显著升高(P<0.01)，HT-A组 (243.03±32.24)、HT-B组(315.78±55.78)、HT-C组(294.35±87.89)血清IFN-γ水平均显著高于HC组(P<0.01,P<0.01,P<0.01)，此外， HT-B组和HT-C组IFN-γ水平均显著高于HT-A组(P<0.01,P=0.043)，HT-B组和HT-C组两组间IFN-γ水平无显著差异(P=0.622)。HT组血清IL-17水平[254.42(221.73～326.40)]较HC组[183.20(167.61～206.64)]显著升高(P<0.01)，HT-A组[233.45(194.62～251.19)]、HT-B组[249.09(218.04～263.40)]和 HT-C 组[304.85(226.01～449.76)]血清IL-17水平较HC组显著升高(P=0.018,P<0.01 ,P<0.01)，此外，HT-A组血清IL-17水平显著低于HT-C组(P=0.012)。见表2。

表2HT组与对照组CD4+CD45RO+记忆性T细胞及细胞因子水平表达

Tab.2Expression of CD4+CD45RO+memory T cells and cytokines between Hashimoto′s Thyroiditis(HT)and Healthy Controls(HC)

ItermsCD4+CD45RO+memoryTcell(%)IFN-γ(pg/ml)IL-17(pg/ml)HT29.31±5.791)282.84±74.421)254.42(221.73-326.40)1)HT-A25.57±4.341)243.03±32.241)233.45(194.62-251.19)1)HT-B30.09±3.801)315.78±55.781)2)249.09(218.04-263.40)1)HT-C31.08±5.841)2)294.35±87.891)2)304.85(226.01-449.76)1)2)HC21.03±3.06188.46±38.08183.20(167.61-206.64)

Note：vs HC,1)P<0.05;vs HT-A,2)P<0.05;vs HT-B,3)P<0.05;IFN-γ.Interferon-γ；IL-17.Interleukin-17.

表3HT组外周血CD4+CD45RO+记忆性T细胞与细胞因子、甲状腺特异性抗体相关性

Tab.3Correlation between CD4+CD45RO+memory T cells，cytokines and thyroid autoantibodies in Hashimoto′s thyroiditis(HT)

ItermsIFN-γIL-17TPOAbTgAbr0.7850.3540.4340.551P<0.010.051=0.015<0.01

2.4相关性分析应用双变量相关性分析HT患者外周血中CD4+CD45RO+记忆性T细胞比例与血清IFN-γ、IL-17、甲状腺相关指标之间的关系，结果显示外周血CD4+CD45RO+记忆性T细胞比例与血清IFN-γ、TPOAb、TgAb均呈正相关(r=0.785,P<0.01;r=0.434,P=0.015;r=0.551,P<0.01),与血清IL-17、TSH无相关性(r=0.354,P=0.051;r=0.322,P=0.077)。见表3。

3　讨论

生理条件下自身反应性T细胞处于非活化状态，无致病作用，但在特定条件下活化、增殖、聚集，最终引发自身免疫性损伤。在外周血中，自身反应性T细胞在接触抗原而被活化后，细胞膜表面的CD45RO表达增强，进一步增强免疫反应[6]。以往研究证实，自身反应性T细胞的异常激活与HT发病密切相关，参与HT的发病过程[7-9]。激活的自身反应性T细胞可与CD4+CD45RO+记忆性T细胞间相互转化，反应过后的自身反应性T细胞大部分凋亡，少数转化为CD4+CD45RO+记忆性T细胞，由初始T细胞转化而来和效应T细胞转化而来的CD4+CD45RO+记忆性T细胞则长期存在于机体内，当再次接受抗原刺激时即刻发生强烈的免疫反应，再次分化为激活的自身反应性T细胞，推测CD4+CD45RO+记忆性T细胞与自身反应性T细胞间的相互转化可能与HT的发病有关。目前尚无CD4+CD45RO+记忆性T细胞与HT发病的相关报道。

本研究中，HT患者外周血单个核细胞中CD4+CD45RO+记忆性T细胞的比例显著高于对照组。我们的结果提示CD4+CD45RO+记忆性T细胞可能参与了HT的发病。有学者研究发现CD4+CD45RO+记忆性T细胞可通过分泌IFN-γ、IL-17加重自身反应性T淋巴细胞的浸润及加重局部炎症反应发挥其生物学作用[10，11]。IFN-γ、IL-17是目前公认的在HT患者中升高且与病情严重程度相关的炎症细胞因子[12，13]，我们的实验亦证明HT患者血清中IFN-γ、IL-17水平较对照组升高。进一步的相关性分析发现，HT患者外周血中CD4+CD45RO+记忆性T细胞比例与IFN-γ水平呈明显正相关，进一步提示CD4+CD45RO+记忆性T细胞可能与HT的发病相关，其可能通过产生IFN-γ等细胞因子作用于HT的发病过程，且通过检测HT患者外周血CD4+CD45RO+记忆性T细胞的比例可以反应HT患者甲状腺自身免疫性炎症状态从而提示病情变化趋势。Taylor等[14]指出CD4+CD45RO+记忆性T细胞的T细胞受体可以更快的产生细胞因子mRNA，故可更加迅速地发挥作用。

除了淋巴细胞浸润，HT的另一个重要特点为可检测出高浓度的甲状腺自身抗体如TPOAb、TgAb，有学者称这两种抗体表明甲状腺自身免疫性损害的严重性[15,16]。95%的HT患者TPOAb阳性，且与甲状腺自身反应性淋巴细胞浸润的数量有很好的相关性，但是健康人中却鲜有发现TPOAb阳性[17]，而且每年有4.3%TPOAb阳性的亚临床患者进展为甲减，而TPOAb阴性的亚临床患者只有2.6%进展为甲减，故TPOAb阳性被认为预示着AITD患者日后可发生甲状腺功能减退[18]，大约90%的HT患者中可发现高滴度的TgAb[19]，但是它在诱发HT中的作用尚不清楚。本研究中，我们发现HT组中外周血CD4+CD45RO+记忆性T细胞与TPOAb、TgAb均呈显著正相关，亦提示CD4+CD45RO+记忆性T淋巴细胞可能参与HT的发病，并且CD4+CD45RO+记忆性T细胞的升高可能有助于预测HT患者可能进展为甲减。

4　结论

总之，本研究显示CD4+CD45RO+记忆性T细胞在HT患者中显著升高，并与IFN-γ、TPOAb、TgAb的表达水平呈正相关，提示CD4+CD45RO+记忆性T细胞可能参与HT的发病过程。但是鉴于记忆性细胞和细胞因子在HT的发病过程中的多效性和网格性的特点，其具体机制仍需进一步探讨。

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[收稿2016-01-07修回2016-03-16]

(编辑许四平)

Expression and significance of CD4+CD45RO+memory T cell in peripheral blood of patients with Hashimoto′s thyroiditis

MA Qian-Qian，LIANG Qiu-Hua，SUN Lin，ZHANG Zheng-Jun，YU Shi-Peng.

Jining Medical University,Jining 272067,China

Objective:To explore the role CD4+CD45RO+memory T cells in the pathogenesis of Hashimoto′s thyroiditis (HT) by detecting the percentages of CD4+CD45RO+memory T cells in peripheral blood mononuclear cells in peripheral blood of newly diagnosed HT patients.Methods: 53HT patients and 43 matched healthy controls (HC) were included in this study.According to the thyroid functions,HT patients were divided into euthyroid subset(HT-A,n =15) ,subclinical hypothyroidism(HT-B,n=14) and overt hypothyroidism subset (HT-C,n=24).The percentages of CD4+CD45RO+memory T cells in PBMCs,as well as the level of serum IFN-γ and IL-17,and thyroid functions,and the titers of thyroid-specific autoantibodies (TPOAb,TgAb) were respectively detected by flow cytometry,ELISA,and ECLIA.Results: The percentages of CD4+CD45RO+memory T cells in PBMCs,as well as the level of serum IFN-γ and IL-17,the titers of TPOAb，TgAb were all significantly higher than that in HC(P<0.01).Bivariate correlation revealed that the percentages of CD4+CD45RO+memory T cells positively correlated with the level of serum IFN-γ,TPOAb and TgAb(P<0.01，P=0.015，P<0.01) in HT patients.Conclusion: The significant increase of CD4+CD45RO+memory T cells in peripheral blood of patients with HT suggested a role of CD4+CD45RO+memory T cells in the pathogenesis of this disease.

Hashimoto′s thyroiditis;Memory T cell;CD4+CD45RO+

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.025

马倩倩(1989年-) ，女，硕士，主要从事内分泌与代谢病的研究，E-mail: MXQ-qianqian@163.com。

及指导教师：于世鹏(1963年-)，男，教授，硕士生导师，主要从事甲状腺疾病方面的研究，E-mail: yushipengjn@163.com。

R581.4

A

1000-484X(2016)10-1527-05

①济宁医学院附属医院兖州院区，济宁272100。