胸腺在EAE小鼠不同临床时期变化的研究

陈晓香　张俊华　盛家和

(郑州大学附属肿瘤医院,河南省肿瘤医院,郑州450008)



胸腺在EAE小鼠不同临床时期变化的研究

陈晓香张俊华盛家和①

(郑州大学附属肿瘤医院,河南省肿瘤医院,郑州450008)

目的：探讨胸腺在EAE小鼠不同临床时期的变化。方法：记录小鼠EAE模型诱导后第0、10、15、20天的胸腺指数和胸腺细胞数；应用流式细胞术观察胸腺细胞的凋亡比例和脾脏CD4+CD44+T细胞的比例；应用PCR和电泳技术观察凋亡因子p53和Bcl-2的含量变化。结果：EAE小鼠在第0、10、15天胸腺指数和胸腺细胞数相应地逐渐减少；第10、15天胸腺细胞凋亡率升高，第10天最高；CD4+CD44+T细胞比例在第10、15天升高，第10天最高；EAE诱导第10天胸腺细胞p53含量升高，而Bcl-2含量降低。结论：EAE小鼠诱导后第15天胸腺萎缩最严重，第10天凋亡率最高，并且与基因p53和Bcl-2调控有关；EAE小鼠胸腺变化与小鼠发病关系密切，并且胸腺又先于临床症状恢复。

EAE；胸腺；凋亡；CD4+CD44+T细胞

多发性硬化症(Multiple sclerosis,MS)是以中枢神经系统炎症和脱髓鞘为发病特点，细胞免疫介导的自身免疫性疾病[1]。目前实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是MS的理想动物模型[2]。胸腺是T淋巴细胞分化发育成熟的主要中枢免疫器官，同时脾脏是T淋巴细胞成熟的外周免疫器官。凋亡是T淋巴细胞在胸腺中分化发育成熟的重要环节[3]。前期有研究称在EAE小鼠体内发现其淋巴器官存在大量的凋亡现象[4]。并且有研究证实了在EAE小鼠胸腺细胞中主要的凋亡细胞群是CD4+CD8+细胞(Double positive,DP)[5]。那么关于EAE诱导后不同时期小鼠胸腺萎缩和细胞凋亡情况的变化以及脾脏CD4+T细胞的变化鲜有报道，并且这些差异与EAE小鼠的发病情况的关系也少有报道。另外，我们通过流式分析来检测小鼠外周脾脏CD4+T细胞的活化情况来了解其迁移情况，并初步解释EAE小鼠的发病机制。

1　材料与方法

1.1实验材料C57BL/6小鼠，体质量(20±2)g，购于北京维通利华实验动物有限公司，饲养在SPF级环境中；髓鞘少突胶质糖蛋白(Myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)，购于上海吉尔生化公司；弗氏完全佐剂(Complete freund′s adjuvant,CFA)，灭活结核分枝杆菌含量5 mg/ml，百日咳毒素(Pertussis toxin,PT)均购于上海三踏生物科技有限公司；大鼠抗小鼠抗体CD4-FITC、CD44-PE等购于eBioscience公司；Annexin V/PI凋亡试剂盒和引物p53和Bcl-2购于上海生工生物工程股份有限公司；TRIzol试剂，PCR扩增混合物(Invtrogen公司)；逆转录试剂盒(爱康生物)；流式细胞仪，BD Calibur(美国)。

1.2方法

1.2.1EAE小鼠模型诱导5 mg/ml CFA与1.5 mg/ml MOG按照1∶1比例混匀，使用乳化管反复推拉混匀，形成油包水样的乳剂。两点背部皮下免疫，使用量为200 μl/只；同时在免疫的第0天和第2天尾静脉注射PT试剂，用量2 μl/只。每天记录小鼠的临床评分，评分标准如下：0分，正常小鼠；0.5分，尾巴部分瘫痪；1分，尾巴完全瘫痪；1.5分，一后肢无力；2分，两后肢均无力；2.5分，一后肢瘫痪，一后肢无力；3分，两后肢均瘫痪；3.5分，前肢无力；4分，一前肢无力，一前肢瘫痪；4.5分，前肢完全瘫痪；5分，死亡。

1.2.2获得胸腺和脾脏分别在EAE小鼠诱导后的第0、10、15、20天取3只小鼠，称量每只小鼠体重，然后颈椎脱臼处死小鼠，打开小鼠胸腔暴露心脏上方白色的胸腺，从根部摘除胸腺。观察胸腺大小，并称量相应小鼠胸腺重量，记录各个阶段每个小鼠胸腺指数(100×胸腺重量/小鼠重量)[6]。按照同样的方法摘除小鼠脾脏。

1.2.3分离小鼠胸腺细胞和脾脏细胞使用剪刀将小鼠的脾脏和胸腺剪碎，使用研磨棒研磨脾脏和胸腺组织块，充分研磨后滤网过滤，1 800 r/min离心5 min弃上清，重悬胸腺细胞备用。脾脏细胞悬液需要使用红细胞裂解液ACK裂解红细胞1 min，PBS终止裂解反应后，70 μm滤网过滤细胞悬液，1 800 r/min离心5 min弃上清，重悬细胞备用。

1.2.4凋亡检测和流式检测取胸腺细胞1×106，按照生工Annexin V/PI试剂盒的操作步骤进行凋亡检测。取脾脏细胞2×106，标记抗小鼠流式抗体CD4-FITC、CD44-PE，使用FlowJo软件分析胸腺细胞凋亡情况和脾脏细胞CD4+T细胞的活化情况。

1.2.5凋亡基因检测1 ml TRIzol (106细胞/管)，提取小鼠胸腺细胞中总mRNA，按照逆转录试剂盒操作步骤获得DNA。DNA定量仪上计数DNA量，每只小鼠取等量的DNA进行DNA扩增。扩增后的产物在3%琼脂糖凝胶(1%溴化乙锭)，100V 50A环境下进行检测。获得的琼脂糖凝胶条带使用BanScan 5.0进行定量分析。

2　结果

2.1EAE小鼠不同临床时期胸腺萎缩情况EAE诱导后第9～10天小鼠开始发病，出现尾部无力麻痹等症状，随后波及小鼠的后肢乃至前肢，第15天小鼠发病达到最高峰(图1A)，第20～22天小鼠的症状明显减轻，逐渐恢复(图1A)；小鼠开始发病至高峰期胸腺指数逐渐降低，在EAE小鼠恢复前期,即第20天，胸腺指数又恢复近正常(图1B)。

2.2EAE小鼠不同临床时期胸腺细胞数变化获取胸腺细胞悬液后，记录胸腺细胞数：小鼠开始发病至高峰期后，与正常小鼠(44.33±9.262)相比，第10天(28.33±6.386)和第15天(3.477±1.818)的胸腺细胞明显减少，并且差异有统计学意义；但是在恢复前期第20天(32.53±6.474)，胸腺细胞明显恢复，且与正常小鼠的差异无统计学意义(图2)。

2.3EAE小鼠不同临床时期胸腺细胞凋亡情况在EAE诱导后第0、10、15、20天4个时间点流式检测凋亡细胞(Annexin V+细胞)的比例，发现在EAE诱导后第10天胸腺细胞的凋亡率最高，与正常组小鼠的凋亡细胞比例差异具有统计学意义，而EAE诱导后第15和第20天，凋亡率仅略高于正常组小鼠(图3A)。我们取凋亡率最高的第10天胸腺细胞，通过提取总mRNA，逆转录，PCR扩增和凝胶电泳来检测基因p53和Bcl-2的含量，发现凋亡基因p53显著增加而抗凋亡基因Bcl-2明显减少(图3B)。

图1　EAE小鼠临床评分和胸腺指数Fig.1　Clinical score and thymic index of EAE mice

图2　EAE诱导后第0、10、15、20天小鼠胸腺细胞数Fig.2　Thymocyte number at 0,10,15,20 days after EAE induction

图3　EAE小鼠不同临床时期胸腺细胞凋亡情况Fig.3　Different clinical period EAE mice thymus cell apoptosisNote: A.Percent of thymocyte apoptosis;B.The content of gene p53 and Bcl-2 at 10 days after EAE induction.

图4　EAE诱导后第0、10、15、20天小鼠脾脏CD4+CD44+T细胞比例Fig.4　Percent of CD4+CD44+T cells in spleen at 0,10,15,20 days after EAE induction

2.4EAE小鼠不同临床时期脾脏CD4+T细胞活化情况获取各个时间点小鼠脾脏细胞，流式检测CD4+CD44+活化细胞的比例，我们可以发现：第10天和第15天脾脏CD4+T细胞的活化比例显著升高，并且与正常组小鼠差异具有统计学意义，在恢复前期第20天活化细胞的比例降低，但是仍旧高于正常组小鼠(图4)。

3　讨论

MS可引起视神经、脑和脊髓等神经障碍，并且由于其较高的发病率、慢性病程和青壮年易得而引起广大学者的关注。CD4+和CD8+T淋巴细胞是浸润MS患者中枢神经系统的主要细胞，尤其是CD4+T淋巴细胞[7]。因此，胸腺作为T淋巴细胞成熟的主要器官，将会是我们研究的主要内容。众所周知，胸腺是一个极其容易萎缩的器官，很多情况都可引起胸腺细胞的凋亡，例如：压力[8]、感染等等。Francelin等[6]学者发现疟原虫感染模型中胸腺细胞大量凋亡并且促使未成熟CD4+CD8+T细胞释放至外周。但是，关于EAE小鼠诱导后不同临床时期小鼠胸腺萎缩和细胞凋亡情况少有报道，并且这些差异可在一定程度上解释EAE小鼠的发病机制。同时，我们检测了凋亡基因p53和Bcl-2在凋亡率最高时间点的含量，来研究凋亡基因是否有参与胸腺细胞的凋亡。为了能够更有说服力的验证胸腺细胞凋亡与EAE小鼠的发病机制存在一定的联系，我们流式检测小鼠外周脾脏CD4+T细胞的活化比例(CD4+CD44+)，因为活化细胞比例升高，证明细胞的迁移能力也升高，在EAE小鼠体内这种活化的细胞一定会迁移至其致病部位，即中枢神经系统。通过这些研究，我们可以初步解释CD4+T细胞在EAE诱导后的成熟、活化和迁移情况，使我们对EAE小鼠的发病机制有更深一步的理解。

EAE诱导后记录其临床评分，通过大量的实验我们绘制出小鼠临床评分表现为：第10天小鼠开始发病，诱导后第15天小鼠发病达到高峰期，第22天小鼠开始恢复。综合考虑实验目的，我们选取第0、10、15、20天4个时间点来研究。我们发现在第0、10、15天3个时间点，小鼠的胸腺指数逐渐降低，并且三者的统计学分析具有统计学意义(P<0.01)。相应的我们发现：正常小鼠胸腺细胞数是(44.33±9.262)×106，第10天减少至(28.33±6.386)×106，第15天细胞数最低(3.477±1.818)×106三者差异具有统计学意义(P<0.05)；但是在恢复前期第20天细胞数增加至(32.53±6.474)×106，这些变化与胸腺指数的变化一致，说明胸腺在EAE小鼠从开始发病至发病高峰期逐渐萎缩，并且在临床恢复前期自我恢复。紧接着，我们流式检测了胸腺细胞中凋亡细胞(Annexin V+)[9]在4个时间点的差异，我们发现：正常小鼠胸腺凋亡细胞的比例为(1.09±0.08)%，在第10天细胞凋亡率达到最高(6.48±0.79)%，在发病高峰期第15天凋亡率明显降低至(1.76±0.23)%，第20天恢复至正常。因此我们得出结论在这4个时间点胸腺细胞的凋亡率在EAE诱导后第10天最高，所以我们选用了第10天的胸腺细胞来研究p53和Bcl-2[10]的关系。经过逆转录，PCR扩增和凝胶电泳，我们发现凋亡率最高的胸腺细胞中促凋亡基因p53升高和抗凋亡基因Bcl-2降低，这些变化在一定程度上说明p53和Bcl-2调控了EAE小鼠胸腺细胞的凋亡。最后，我们研究了外周脾脏CD4+T细胞的活化情况，发现第10、15天CD4+CD44+T细胞的比例显著升高，并且第10天活化细胞的比例最高。

综上所述，我们认为在EAE小鼠第10天胸腺细胞的凋亡情况最严重并且外周CD4+T细胞的活化比例也最高，但是胸腺的萎缩和细胞的数量变化均在发病高峰期第15天最明显，说明EAE小鼠在第10天胸腺细胞通过高凋亡率来加快T淋巴细胞的分化和成熟，最终促使第15天小鼠T细胞浸润中枢神经系统最严重。同时，在我们研究中发现EAE小鼠发病前期第20天，胸腺细胞数、胸腺细胞的凋亡率和脾脏CD4+T细胞的活化程度均接近正常小鼠，说明胸腺先于临床症状的自复能力[3]。Duszczyszyn等[11]学者认为RRMS患者体内可见明显的胸腺萎缩，同时又补偿性的升高外周T细胞的增殖反应来产生患者体内的自体反应性淋巴细胞。前期也有研究称大量凋亡现象存在于EAE小鼠的免疫器官中，并且这些凋亡可改变Th1/Th2的免疫反应，增加MOG-T细胞的产生，进而加强EAE临床表现[4]。同时也有报道称胸腺可通过IL-17信号通路加速Foxp3+T细胞的分化，进而改善EAE小鼠的临床症状[12]。可见，胸腺可调节EAE小鼠的发病和恢复。我们的研究与前期研究结果证实了胸腺在EAE小鼠发病初期通过增加凋亡率来促使疾病的发展，而又先于临床症状恢复来促使疾病的恢复。

虽然，我们的研究在一定程度上探讨了胸腺在EAE不同临床时期的变化，也能在一定程度上解释EAE小鼠的发病机制和胸腺在EAE小鼠发病过程中的主要作用。但是，我们的研究还不能详细阐述T淋巴细胞在胸腺中的分化发育成熟机制与EAE小鼠临床症状的关系，更不能解释外周活化T细胞是通过什么样的机制穿过血脑屏障并迁移至致病部位的。所以，T细胞在胸腺中的发育过程和T细胞从外周免疫器官迁移至中枢神经系统的过程，将会是我们以后的研究重点。

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[收稿2015-11-20]

(编辑倪鹏)

Study on change of thymus in different clinical period of EAE mice

CHEN Xiao-Xiang,ZHANG Jun-Hua，SHENG Jia-He.

Department of Clinical Laboratory，The Affiliated Tumor Hospital of Zhengzhou University,Henan Tumor Hospital,Zhengzhou 450008,China

Objective:To investigate the change of thymus in different period of EAE mice.Methods: The thymic index and thymocyte number at 0,10,15,20 days after EAE induced were recorded.The percent of thymic apoptosis and CD4+CD44+T cells in spleen was acquired by Flow Cytometry.The content of p53 and Bcl-2 gene was detected by PCR and electrophoretic technique.Results: The thymic index and thymocyte number correspondingly reduced at 0,10,15 days after EAE induced.Apoptotic rate of thymocyte increased at 10,15 days after EAE induced,highest at 10 days.The percent of CD4+CD44+T cells also increased at 10,15 days after EAE induced,highest at 10 days.The content of p53 increased,while Bcl-2 reduced at 10 days after EAE induced.Conclusion: The atrophy of thymus is most serious at 15 days after induction;while the apoptotic percent is highest at 10 days after induction,which have a relationship with regulation of p53 and Bcl-2.The change of thymus in EAE mice closely related with EAE attack,and the recovery of thymus precede EAE.

EAE;Thymus;Apoptosis;CD4+CD44+T cells

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.010

，E-mail：shjh6208@163.com。

陈晓香(1967年-)，女，副主任技师，主要从事自身免疫性疾病与分子诊断学方面的研究，E-mail:15936229361@163.com。

R392.3

A

1000-484X(2016)10-1454-04