GeneXpert系统在肺结核中的诊断价值
2016-11-11范玲玲李彩霞黄黎俐蔡晓平
范玲玲 李彩霞 黄黎俐 蔡晓平
GeneXpert系统在肺结核中的诊断价值
范玲玲李彩霞黄黎俐蔡晓平
目的 评价GeneXpert MTB/RIF系统在肺结核中的诊断价值。方法 对408例疑诊肺结核的患者痰样本分别进行痰抗酸镜检(AFB)、结核分枝杆菌培养(MTB)和GeneXpert MTB/RIF检测,并进行比较。结果 以临床确诊为金标准,抗酸涂片镜检、TB培养和GeneXpert MTB/RIF检测的敏感性分别为85.7%、99.0%、100%;以临床确诊+临床诊断为金标准,抗酸涂片镜检、TB培养和GeneXpert MTB/RIF检测的敏感性分别为38.0%%、43.9%、45.1%;GeneXpert敏感性高于抗酸涂片镜检(P<0.05),等同于结核培养;GeneXpert菌量梯度与抗酸涂片镜检等级呈一定正相关(r=0.672);GeneXpert利福平耐药测定与传统比例法药敏测定具有明显相关性(kappa=0.951)。结论 GeneXpert MTB/RIF系统在肺结核诊断、疗效观察及预后评估具有重要价值。
肺结核 利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术 抗酸染色 结核分枝杆菌培养
结核病实验诊断是为结核病的确诊提供病原学证据唯一手段,目前实验室诊断主要依赖抗酸染色和TB培养等传统方法,但抗酸涂片检查存在检出率低、无法区分结核与非结核分支杆菌等问题,TB培养亦存在污染率高、检测时间长等缺点,致使部分结核患者无法及时准确诊断。世界卫生组织向全球结核病防治领域推荐利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(GeneXpert Mtb/RIF,以下简称GeneXpert)分子生物学检测方法,既能检测结核病又能检测耐利福平结核病,且能在<2.5h获得结果,明显缩短结核病的检测时间[1-3]。本文探讨GeneXpert系统在肺结核中的诊断价值。
1 临床资料
1.1一般资料 收集2014年7月至2015年12月本院感染科和呼吸科收治的疑诊结核患者408例,其中男288例,女120例;年龄9~88岁,平均年龄(43.3±19.2)岁。纳入标准:咳嗽、咯痰时间>2周,因呼吸道症状接受检查的初治结核病疑似患者,排除抗结核药物治疗患者。根据《WS 288-2008肺结核诊断标准》分为4类,分别为确诊病例、临床诊断病例、非结核病病例;在患者出院时仍无法明确诊断归为无法诊断病例。
1.2仪器与试剂 GeneXpert检测系统和检测试剂盒购自美国Cepheid公司;酸性改良罗氏培养基由杭州创新生物检控技术有限公司提供;抗酸染色液试剂由珠海贝索生物有限公司提供。
1.3方法 (1)抗酸涂片镜检:所有患者均取随机痰标本进行涂片、抗酸染色、镜检,痰涂片检查按《痰涂片镜检实验室质量保证手册》操作。(2)结核培养:每个患者痰涂片后剩余的样本取1ml用40g/L的NaOH处理后接种至酸性罗氏培养基上,35℃孵育,每周观察TB生长情况,连续观察8周,无TB生长为培养阴性。(3)结核杆菌药敏试验:对结核分枝杆菌培养阳性者,挑取培养基上3周新鲜的菌落,采用比例法做药敏试验。菌液最终接种量为10-4mg和10-6mg,利福平在培养基内的最终浓度为40μg/ml。药敏试验按《结核分枝杆菌药物敏感性试验标准化操作程序及质量保证手册》严格操作。(4)GeneXpea 系统检验:每个患者痰涂片后剩余的样本取1ml进行 GeneXpert 系统检验,2.5h后观察检测结果。
1.4结果判定 (1)抗酸涂片染色镜检:根据AFB结果分为阴性、≤9条/300视野、+、++、+++、++++。(2)结核培养:根据罗氏培养基斜面菌落数占斜面面积多少,分为阴性、+、++、+++、++++。(3)GeneXpert系统检测:MTB数量以MTB DNA拷贝的高低分为未检出、极低、低、中、高5个量级。利福平检测结果为敏感或耐药。1.5 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件。数据采用配对χ2检验、等级相关检验和kappa检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1患者诊断情况 408例患者确诊结核病105例(25.7%),临床诊断结核病132例(32.4%),162例(39.7%)排除结核病,9例(2.2%)患者无法明确诊断。2.2 实验室检测结果 105例确诊结核病患者的痰样本中结核涂片和培养同时阳性89例,89例患者GeneXpert均阳性;结核培养阳性涂片阴性患者15例,15例患者GeneXpert均阳性;涂片阳性培养阴性1例,1例患者GeneXpert阳性;临床诊断为肺结核的132例患者结核涂片、培养均阴性,GeneXpert阳性2例。162例临床排除为结核的患者中有3例抗酸涂片和结核培养阳性,GeneXpert为阴性,细菌鉴定证实这三株细菌均为非结核分支杆菌。
2.3三种实验室结果比较 408例患者以结核确诊病例为金标准,结核患者105例,抗酸涂片镜检结果的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为85.7%、99.0%、96.7%、95.2%;结核培养结果的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为99.0%、99.0%、97.2%、99.7%;GeneXpert结果的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为100%、100%、100%、100%。GeneXpert的敏感性100%高于抗酸涂片的85.7%,差异有统计学意义(P<0.05);GeneXpe的敏感100%高于结核培养的99.0%,但差异无统计学意义(P>0.05)。以结核确诊病例+临床诊断病例为金标准,结核患者237例,抗酸涂片镜检结果的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为38.0%、98.2%、96.8%、53.3%;结核培养结果的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为43.9%、98.2%、97.2%、55.8%;GeneXpert结果的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为45.1%、100%、100%、56.8%。GeneXpert的敏感性44.9%高于抗酸涂片的38.0%,差异有统计学意义(P<0.05);GeneXpert的敏感性45.1%高于结核培养44.9%,但差异无统计学意义(P>0.05)。
2.4GeneXpert量级与抗酸涂片镜检结果等级的比较 将107例GeneXpert阳性结果标本与其相对应的镜检结果进行Spearnman等级相关比较,可知涂片结果等级与GeneXpert 结果量级呈现一定的正相关趋势(r=0.672,P<0.05)。有17例涂片镜检结果为阴性而GeneXpert 量级为极低11例、低6例;6例镜检结果为高倍镜视野<9条/300个时,GeneXpert相对应的量级出现4例中、1例高2个量级;27例镜检结果为+时,GeneXpert相对应的量级出现13例低、14例中2个量级;40例镜检结果为++时,GeneXpert相对应的量级出现28例中、12例高2个量级;15例镜检结果为+++时,GeneXpert相对应的量级出现15例中1个量级;2例镜检结果为++++时,GeneXpert相对应的量级出现2例高1个量级。见图1。
图1 GeneXpert检验结果量级与抗酸涂片镜检量级的相互关系
2.5利福平耐药的比较 GeneXpert检测阳性的105例标本中,93例利福平敏感,12例利福平耐药;与培养后的药敏结果比较,其中92例敏感标本与金标准传统药敏方法完全符合,1例由于培养阴性未做药敏而无法比较,12例利福平耐药的标本,其中11例与传统药敏方法比较完全符合,另外1例GeneXpert结果为耐药而传统方法为敏感,一致率为99.0%(103/104),kappa值0.951>0.75,表明2种方法检测利福平药敏结果具有较好的一致性。
3 讨论
GeneXpert使用了半定量的巢式荧光定量PCR,在理论上GeneXpert能获得较高的检测灵敏度[4]。在本资料中,以临床确诊为金标准时,105例患者中GeneXpert系统可检测出100%的阳性,其敏感度高于抗酸涂片镜检85.7%(P<0.05),且特异性也达100%,高于抗酸涂片镜检99.0%;在以临床确诊+临床诊断为金标准时,237例病例中GeneXpert系统可检测出45.1%的阳性结果,其敏感度高于抗酸涂片镜检的38.0%(P<0.05),且特异性也达到100%,高于抗酸涂片镜检98.2%。与结核培养比较,以临床确诊为金标准时,105例比较中GeneXpert系统可检测出100%的阳性,其敏感度高于结核培养的99.0%,但差异无统计学意义;在以临床确诊+临床诊断为金标准时,GeneXpert系统可检测出45.1%的阳性结果高于结核培养的43.9%,但差异无统计学意义。表明GeneXpert检测结核的敏感性高于抗酸涂片镜检,等同于甚至略高于结核培养。在162例排除为结核患者的标本中有3例患者结核培养和结核涂片均阳性,GeneXpert为阴性,菌株经鉴定为非结核分支杆菌。表明抗酸涂片无法区分结核和非结核分支杆菌,结核培养阳性需要经细菌鉴定才能明确。碰到抗酸涂片阳性标本而GeneXpert阴性时应怀疑非结核分支杆菌感染。
本资料中GeneXpert量级与抗酸镜检呈现正相关,但是相关关系一般,相关系数为0.672。当抗酸染色结果为阴性时,GeneXpert MTB/RIF系统也能检测出阳性结果,甚至当抗酸涂片镜检结果为高倍镜视野<9条/300个时,GeneXpert相对应的量级可出现低、中、高三个量级。可能因为GeneXpert选取较多标本量且经预处理使菌量均匀分布,而抗酸涂片镜检制片时随机挑取部分少量标本导致涂片的假阴性或涂片局部菌量分布不均。
GeneXpert系统能快速检测出利福平耐药株,而MTB培养和抗酸涂片镜检无法获得其耐药性的信息。GeneXpert针对rpoB基因81bp利福平耐药核心区间(RRDR)设计引物、探针(A、B、C、D、E),检测是否发生突变,进而诊断患者是否出现利福平耐药[5-6]。本资料GeneXpert检测耐利福平突变位点与传统的结核药敏的比例法一致性为99.0%(103/104),kappa值0.951>0.75,表明两种方法检测利福平药敏结果具有较好的一致性。但传统的结核培养和结核药敏耗时近8周,而GeneXpea系统可在2 h快速完成对利福平的敏感检测,有利于结核病的早期治疗。
综上所述,GeneXpert 系统检测结核具有快速简单、操作自动化、敏感性、特异性高、结果准确、可半定量显示标本带菌量、可检测利福平药敏等优点,非常适合我国结核病的快速诊断和早期治疗。
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Objective To evaluate the diagnostic value of GeneXpert MTB/RIF system in patients with pulmonary tuberculosis. Methods Total of 408 cases of sputum samples from the pulmonary tuberculosis and suspected pulmonary tuberculosis patients were collected,and tested by acid fast staining(AFB),Mycobacterium tuberculosis(MTB)culture and GeneXpert MTB/RIF system,the Results were compared. Results Clinical confi rmed diagnosis as gold standard,the susceptibility of acid fast staining 、TB culture and GeneXpert MTB/RIF was 85.7%%、99.0%、100% respectively;Clinical confi rmed diagnosis+Clinical diagnosis as gold standard,the sensitive was 38.0%、43.9%、45.1% respectively;the sensitivity of GeneXpert MTB/RIF was higher than acid fast staining(P<0.05),equivalent to tuberculosis culture;GeneXpert MTB/RIF bacterial content gradient was positively correlated with acid fast staining(r=0.672);GeneXpert determination of rifampin resistance and the proportion of drug sensitivity with good correlation(kappa=0.951). Conclusion GeneXpertMTB/RIF system has important value in the diagnosis,assessment of curative effect and prognosis of pulmonary tuberculosis.
Pulmonary tuberculosis GeneXpertMTB/RIF Acid fast staining Mycobacterium tuberculosis culture
323000 浙江省丽水市人民医院