加味丹参饮预处理中JAK2/STAT3通路对大鼠心肌细胞的保护机制研究

姚橘泉　常　拓　傅大霖　王庆高

（1.广西中医药大学，广西 南宁 530001；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530001）

加味丹参饮预处理中JAK2/STAT3通路对大鼠心肌细胞的保护机制研究

姚橘泉1常拓1傅大霖1王庆高2

（1.广西中医药大学，广西 南宁 530001；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530001）

目的：研究JAK2/STAT3通路在加味丹参饮预处理中对大鼠心肌细胞再灌注损伤的调控作用，从信号转导水平探讨加味丹参饮对梗死大鼠心肌的保护机制。方法：1.取各组大鼠各三只以Evans-bule，TTC双染色法染色心肌，测定心肌梗死面积。2.石蜡包埋，切片，在光镜行细胞心态学观察。3.取各组大鼠各三只Western blot测定各组心肌细胞JAK2、STAT3蛋白的表达。最后应用SPSS 17.0 for Windows统计软件将实验结果进行统计学处理。多组比较采用单因素方差分析，p ＜0.05认为有统计学意义。结果：1.I/R组ST段向上抬高约0.75（心电图背景的一竖格记为1）。加味丹参饮预处理组，ST抬高为0.50，下降了约33.3%。2.JDD组比I/R组梗死面积减少11%。3.加味丹参饮预处理组病理改变较I/R轻。4.I/R组的灰度值低于其他4组，有显著差异（p＜0.05）。JDD组JAK2、STAT3表达与I/R组比较，有明显的差异（P ＜0.05），JDD+AG490组，JDD+RPM组的STAT3灰度值明显低于IPC组，有显著性差异（P＜0.05）。JDD+RPM组的JAK2灰度值低于其他组，有显著性差异（P＜0.05）。结论：在心肌梗死再灌注后存在缺血再灌注损伤，加味丹参饮预处理能有效对抗这种损伤，减轻心肌缺血再灌注损伤，降低心电图抬高的ST段，改变心肌细胞的病理形态学，其机制与JAK/STAT转导通路的干预有关，在JAK2/STAT3通路中，JAK2对STAT3有调控作用，而stat3对JAK2的表达同样有反馈作用。他们共同在缺血再灌注损伤中起到保护缺血心肌的作用。加味丹参饮预处理通过激活JAK/STAT转导通路，参与心肌细胞凋亡的保护。

JAK2/STAT3转导通路；加味丹参饮；缺血预处理；缺血再灌注损伤

随着人们生活方式的改变，心血管疾病已经成为危害人类健康的主要疾病之一，心肌梗死急性期治疗的原则是尽快缺血心肌的血供。但是，心肌缺血再灌注（I/R）可以导致复杂的生理病理变化，即缺血再灌注损伤（reperfusion injury）。缺血再灌注损伤可使缺血区存活心肌及血管内皮细胞发生可逆及不可逆损伤坏死，导致缺血损伤加重及坏死面积加大。因此，解决再灌注损伤对心肌的再次伤害成为当务之急。

加味丹参饮在丹参饮（《时方歌括》）基础上加川芎、赤芍、当归、黄芪、扶芳藤、青蒿、黄连等药化裁而成，功用行气活血、化瘀解毒。该方以丹参为君，以活血化瘀。佐以当归、扶芳藤补血活血，即取“若欲通之，必先充之”之意。川芎、赤芍、黄芪、檀香活血行气，使气行则血行。青蒿、黄连，清解瘀毒。青蒿素能减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤，其机制可能与青蒿具有抗氧化和清除自由基的作用有关。

而JAK/STAT转导信号通路是1992年发现的，涉及免疫、细胞增殖分化、细胞凋亡、炎症、肿瘤等多种生理、病理过程的重要细胞内信号转导通路。心力衰竭、缺血预处理诱导的心肌保护以及缺血再灌注引起的心功能障碍都与这个信号通路密切相关。其中JAK2/STAT3起到保护心肌的作用。那么，共同作为保护心肌的机制，加味丹参饮及JAK2/STAT3之间是否存在一定的内在联系呢？本实验此问题进行多层面的探讨。

1　实验方法

健康Wister大鼠50只，每只250～300g，适应性喂养一周后，将90只大鼠按照随机数字法分为正常组（NC组）、缺血再灌注组（I/R组）、加味丹参饮预处理组（JDD组）、加味丹参饮+雷帕霉素组（JDD+RPM）组、加味丹参饮+JAK抑制剂α-氰基-（3，4-羟基）N-苄苯乙烯胺组（JDD+AG490组）。按照《药理实验方法学》（徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学［M］.3版.北京:人民卫生出版社，2001:1179.）的造模方法制作心肌缺血再灌注模型。实时监测心电图，心电图ST段向上抬高为结扎成功。结束后：（1）取各组大鼠各三只以Evans-bule，TTC双染色法染色心肌，测定心肌梗死面积，梗塞面积以坏死心肌重量与缺血区心肌重量之比表示。再取各组大鼠各三只石蜡包埋，石蜡包埋，切片，二甲苯脱蜡，常规HE染色，树脂封片。在光镜下以HP10x40行细胞心态学观察。（2）取各组大鼠各三只Western blot测定各组心肌细胞JAK2、STAT3蛋白的表达。最后应用SPSS 17.0 for Windows统计软件将实验结果进行统计学处理。多组比较采用单因素方差分析，p＜0.05认为有统计学意义。

2　相关结果结论

2.1心电图

结扎冠脉不同的时间后可造成心肌细胞不同程度的缺血损害。本实验取结扎45min时的实施心电图，多组对比后发现：I/R组在缺血结扎45 min时，ST段向上抬高约0.75（图2，心电图背景的一竖格记为1）。JDD组反复4次的5 min结扎，10 min再灌注的预处理后，再缺血结扎45 min时，ST段抬高有下降，ST抬高为0.50，下降了约33.3%（图3，图4）。说明JDD预处理可以改善缺血再灌注损伤心电图。而与JDD+AG490组相比较，JDD组ST段抬高有所下降约0.2（图3，图4），说明JDD预处理有一定的拮抗AG490对JAK2的抑制效果。

图1　正常心电图

图2　I/R结扎45 min

图3　加味丹参饮预处理结扎45 min

图4　JDD+AG490结扎45 min

2.2心肌梗死面积的测定

图5　Evans-bule，TTC双染色后心肌

结果显示JDD组比I/R组梗死面积减少（p＜0.05），说明JDD预处理可以保护心肌缺血再灌注损伤；JDD+AG490组与JDD组相比，梗死面积增加（P＜0.05），说明JAK2/STAT3通路在缺血再灌注损伤中有保护心肌不收损伤的功效。见表1。

表1　心肌梗死面积比较（%

表1　心肌梗死面积比较（%

注：两两比较，与I/R组比较△p＜0.05 ，与IPC组比较 *p＜0.05

组别 梗死面积正常组 19.05%±0.34 I/R组 25.80%±0.31△JDD组 13.98%±0.36△JDD+AG490 19.94%±0.57*

3　病理观察

结果显示正常组的心肌组织未见充血、出血或炎性细胞浸润，心肌肌原纤维排列整齐，肌节长度一致、排列规整，横纹清晰，染色质清楚。I/R组的心肌纤维变长，排列紊乱和断裂，肌纤维间距增宽，肌节缩短，排列不规整，间质水肿、充血或出血，有炎症细胞浸润。加味丹参饮预处理组虽有心肌的损伤但是心肌肌原纤维排列较规整，肌节排列亦较为整齐，偶见炎性细胞与红细胞浸润，病变较I/R轻。说明加味丹参饮预处理与IPC能减轻心肌梗死再灌注损伤的作用（图6）。

图6　左I/R组，右加味丹参饮预处理组

4　加味丹参饮预处理对JAK2/STAT3蛋白表达的影响

笔者将正常组设为A组，I/R组设为B组，JDD组设为C组，JDD+AG490组设为D组，JDD+RPM组设为E组进行Western blot测定可以发现：

（1）对于JAK2蛋白来讲，与正常组比较，I/R组反而有所降低，差异有统计学意义（p＜0.05），说明在正常组织中，JAK2蛋白即有所表达，但在缺血再灌注损伤中，受到某种原因抑制。而JDD组JAK2蛋白的表达水平高于正常组且高于I/R组（B组），有明显的差异（P＜0.05）。说明加味丹参饮预处理都可以激活JAK2的表达（表2）。

表2　各组灰度水平比较（）

表2　各组灰度水平比较（）

注：两两比较，与正常组比较**p＜0.05，与I/R组比较△p＜0.05，与JDD组比较*p＜0.05，***p＜0.05

组别 n JAK2 STAT3 A组 5 73.2±5.9 103.6±5.1 B组 5 63.4±3.6 ** 98.4±3.1** C组 5 109.6±4.7△ 143.2±5.8△* D组 5 99.3±1.8△* 117.3±6.6*** E组 5 114.1±1.8*** 123.3±6.6*

（2）同样对于STAT3蛋白来讲，I/R组表达低于正常组，差异有统计学意义（p＜0.05），即缺血再灌注损伤中，STAT3的表达一样受到某种原因的抑制。暗中提示JAK2与STAT3有存在某种联系。而JDD组STAT3蛋白表达水平依旧高于正常组与I/R组，有明显的差异（p＜0.01），说明JDD预处理也可以提高STAT3的表达水平。

（3）在加入了JAK2抑制剂AG490后，JDD+AG490组的灰度值也明显低于JDD组，有显著差异（p＜0.05）。结合梗死面积及病理观察可知在加入了抑制剂后，JDD+AG490组梗死面积增大，病态组织细胞增多，可以说明抑制了JAK2蛋白的表达后，缺血预处理与加味丹参饮预处理保护心肌再灌注损伤的作用都会减弱，即在IPC与JDD保护心肌再灌注损伤的过程中，JAK2蛋白起着重要的作用。

（4）同样在加入了STAT3抑制剂RPM后，JDD+RPM组的灰度值也明显低于JDD组，有显著差异（p＜0.05）。同样结合梗死面积及病理观察可以说明STAT3蛋白也在缺血预处理与加味丹参饮预处理保护心肌再灌注损伤的过程中起着重要的作用。

（5）同时笔者还发现与JDD组比较，JDD+AG490组的STAT3蛋白的灰度值也明显降低，差异有统计学意义（p＜0.05）。说明在抑制了JAK2蛋白的表达后，STAT3蛋白的表达也受到了抑制。即JAK2蛋白参与了调控STAT3蛋白的表达水平。而与JDD组比较，JDD+RPM组的JAK2蛋白的灰度值反而有所增高，说明在抑制了STAT3蛋白的表达后，对JAK2蛋白的表达有反馈增强作用。揭示了JAK2蛋白与STAT3蛋白的内在联系。

图7　各组JAK2/STAT3的免疫印迹的图片及柱状图

综上所述，可得出结论在心肌梗死再灌注后存在缺血再灌注损伤，加味丹参饮预处理能有效对抗这种损伤，减轻心肌缺血再灌注损伤，降低心电图抬高的ST段，改变心肌细胞的病理形态学，其机制与JAK2/STAT3转导通路的干预有关，在JAK2/STAT3通路中，JAK2对STAT3有调控作用，而STAT3对c-myc有调控作用，反过来讲，c-myc对stat3的表达有一定影响，而stat3对JAK2的表达同样有反馈作用。他们共同在缺血再灌注损伤中起到保护缺血心肌的作用。加味丹参饮预处理通过激活JAK2/STAT3转导通路，参与心肌细胞凋亡的保护。

5　讨论

JAK/STAT转导通路中JAK1、JAK2、STAT1、STAT3与IPC相关［1］。Hattori等［2］报道离体大鼠心脏模型在IPC后即刻和再灌注2h JAK2和STAT3酪氨酸磷酸化增加，同时心功能改善，梗死面积和凋亡细胞数减少。表明JAK2/STAT3通路有保护心肌再灌注损伤的作用。王高频等［3］在离体大鼠心脏I/R过程的实验中发现，随着再灌注时间的延长，心功能逐渐恶化，坏死心肌细胞数逐渐增多，JAK/STAT通路的两个亚型STATl、STAT3均被激活。在缺血30min 时STAT3 即被激活，先于大量心肌细胞坏死和明显心功能恶化之前，随后的再灌注过程中STAT3保持原有激活状态，与缺血30 min比未见进一步增高，而STATl的激活则迟于STAT3，在缺血30 min时未见明显变化，在再灌注5 min开始激活，30 min达到高峰，后略有降低，但仍处于较高水平的激活状态。从上述实验结果可以看出，STAT3蛋白的激活存在于整个缺血及再灌注过程中，其与心功能和心肌细胞坏死程度呈高度相关性，说明STAT3蛋白参与了I/R损伤，IPC修复的全过程。已有报道［4］，给予小鼠6个循环的4min缺血4min再灌注，IPC后即刻在再灌注区即可见JAK2的激活。而在IPC后30min，Western Blot表明STAT3从胞质易位到核，伴有核内2种蛋白成分磷酸化的增多，说明这两种转录因子被激活。参与了IPC的保护作用。本实验中，IPC组与JDD组的JAK2/STAT3蛋白明显高于I/R组，与上述试验结果一致，结合病理梗死面积等试验可得出结论，JAK2/STAT3蛋白在心肌缺血再灌注的损伤中起保护心肌细胞的作用。

加味丹参饮关于心肌缺血预处理已经有了不少研究，动物实验结果也已经取得了成效。易刚强［5］，李鑫辉［6］，苏伟［7］等的实验研究结果表明加味丹参饮能够降低心肌酶谱的水平从而达到保护心肌的作用；廖菁等［8］的做了加味丹参饮预处理的实验在证明加味丹参饮预处理能够抑制血小板的粘附与聚集，预防冠心病的发生；李鑫辉［9-10］究证明了对于抑制心肌细胞的凋亡及降低炎症因子水平的保护作用，加味丹参饮预处理后也能做到；王庆高等［11］，黄政德等［12］的研究表明用加味丹参饮对大鼠的心肌预处理后发现能够延迟心肌的损伤从而保护心肌损伤的作用；黄政德等［13］还做了兔实验研究证明加味丹参饮预处理后能够改善心功能，改善生活质量；李鑫辉［14］的实验得出了加味丹参饮预处理能够改善动脉内皮功能及超微架构的作用，预防心肌重构，抑制心肌肥大等作用。

6　结语

目前西医研究最多的是与缺血机制有关的受体、酶、离子通道的特异性激动剂及抑制剂，如腺苷A1受体兴奋剂R-PLA，蛋白激酶C的激动剂DOG，ATP依赖钾通道激动剂等，但这些药物具有西药的典型副作用，同时缺少运用于临床的实验依据，尚不能放心的在临床上使用［15］。而祖国医学在这方面有很大优势，如扶芳藤，青蒿等再如本文的加味丹参饮。所以，探讨药物预处理对缺血再灌注损伤心肌的保护，发扬传统医学，还需进行进一步的研究和探索。

［1］ Booz GW，Day JNE，Baker KM.Interplay between the cardiac renin angiotensin system and JAK-STAT signaling:Role in cardiac hypertrophy， ischemia/reperfasion dysfuntion，and heart failure［J］.J Mol Cell Cardiol，2002，34（11）:1443.

［2］ Hattori R，Maulik N， Otani H，et al. Role of STAT3 in ischemic preconditioning［J］.J Mol Cell Cardiol，2001，33: 1929-1936.

［3］ 王高频，孙英贤，刘义.JAK/STAT信号通路在离体大鼠心肌缺血再灌注损伤激活时辰的研究［J］.陕西医药杂志，2007，36（5）:413-416.

［4］ Xuan YT，Guo Y，Han H，et al. A essential role of the JAK/ STAT pathway in ischemic preconditioning［J］. Proc Natl Acad SciUSA，2001，98:9050-9055.

［5］ 易刚强，黄政德，邓红霞，等.加味丹参饮对麻醉犬心肌缺血及相关血液生化指标的影响［J］.湖南中医学院学报，2006，26（3）:9-11.

［6］ 李鑫辉，黄政德，葛金文，等.加味丹参饮对血瘀证兔心肌缺血再灌注损伤的影响［J］.中国中医药信息杂志，2011，18（6）:37-39.

［7］ 苏伟，陈军，吴星，等.加味丹参饮对麻醉动物急性心肌缺血保护作用研究［J］.陕西中医，2013，34（9）: 1265-1267.

［8］ 廖菁，黄政德，胡华，等.加味丹参饮对大鼠实验性心肌缺血损伤的抗凝血作用研究［J］.中国中医药信息杂志，2009，16（1）:44.

［9］ 李鑫辉，黄政德，喻嵘，等.加味丹参饮对血瘀证家兔缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡的影响［J］.湖南中医药大学学报，2009，29（4）:21.

［10］ 李鑫辉，黄政德，葛金文，等.加味丹参饮对心肌缺血再灌注损伤血瘀证兔肿瘤坏死因子A和白细胞介素-2的影响［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2011，1（9）:53-55.

［11］ 王庆高，李成林，卢健棋，等.加味丹参饮预处理诱导大鼠心肌细胞HSP70mRNA的表达［J］.环球中医药，2009，2（2）: 102.

［12］ 黄政德，葛金文，张玉生，等.加昧丹参饮预处理对缺损伤家兔心电图改变血再灌注的影响［J］.湖南中医药导报，2003，9（11）:56-58.

［13］ 黄政德，葛金文，张玉生，等.加味丹参饮预处理对缺血再灌注损伤家兔心功能的影响［J］.湖南中医学院学报，2003（23）:4-6.

［14］ 李鑫辉，黄政德，葛金文，等.加味丹参饮对血痕证心肌缺血再灌注损伤家兔内皮细胞保护作用研究［J］.中国药师，2011，14（1）:3-6.

［15］ 谭元生，邓圣明，谭超.药物预处理对缺血再灌注损伤心肌的保护作用［J］.中医药学刊，2003，21（6）:877.

Study on the protective mechanism of Jiaweidanshenyin preconditioning on JAK2/STAT3 pathway in rat myocardial cells

Objective: To study the regulation of JAK2/STAT3 signaling pathway in Jiaweidanshenyin preconditioning on myocardial cells of ischemia-reperfusion injury in rats and investigate the protective mechanism of Jiawei Danshen Decoction on myocardial infarction in rats from signal transduction. Methods: 1 rats of each three to Evans-bule， TTC double staining of myocardium， myocardial infarct size was determined， 2 paraffin embedded sections， observed under light microscope for cell mentality. The expression of 3 rats each take three Western blot measured the myocardial cell JAK2， STAT3 protein. The application of SPSS 17 for Windows statistical software test results were analysed statistically. Multiple groups were compared with single factor analysis of variance， P ＜0.05 was considered statistically significant. Results: the ST segment of the 1.I/R group was raised up to about 0.75 （a vertical grid of the ECG background was 1）. Modified Danshen Decoction pretreatment group， ST elevation of 0.50， a decrease of about 33.3%. The infarct area of 2.JDD group was 11% less than that of group I/R. 3 the pathological changes of the pretreatment group were lighter than I/R. The gray value of 4.I/R group was lower than the other 4 groups， and there was significant difference （p＜0.05）. JAK2 and STAT3 expression in JDD group compared with I/R group， with significant difference （P ＜0.05）， JDD+AG490 group， JDD+RPM group， the gray value of STAT3 was significantly lower than IPC group，there was significant difference （P＜0.05）. In group JDD+RPM， the gray value of JAK2 was lower than that of the other group， there was significant difference （P＜0.05）.Conclusion: in the myocardial infarction and reperfusion of ischemia reperfusion injury， Jiawei Danshen Decoction pre treatment can be effective against this damage， reduce myocardial ischemia reperfusion injury， reduce the elevation of electrocardiogram ST segment， morphological changes of myocardial cells， and the mechanism of JAK / STAT pathway related to the intervention， in the JAK2 / STAT3 pathway in JAK2 STAT3 have regulation， and expression of JAK2 STAT3 also feedback. They are common in ischemia reperfusion to protect myocardial ischemia injury in rats. Jiaweidanshenyin preconditioning via activation of JAK/STAT signaling pathway， involved in the protection of myocardial cell apoptosis.

JAK2/STAT3 transduction pathway； Jiaweidanshenyin； ischemic preconditioning； ischemia reperfusion injury

R28

A

1008-1151（2016）04-0066-04

2016-03-03

国家自然科学基金项目（81160437）。

姚橘泉，广西中医药大学在读硕士，从事中西医结合防治心血管疾病研究。

王庆高，广西中医药大学第一附属医院副教授，从事中西医结合防治心血管疾病研究。