中国少数民族全基因组DNA高通量提取及其样本库建立

张一鸣，王俊丽，黄婧婧，张荣荣，彭耀

(中央民族大学 生命与环境科学学院，北京　100081)



中国少数民族全基因组DNA高通量提取及其样本库建立

张一鸣，王俊丽，黄婧婧，张荣荣，彭耀

(中央民族大学 生命与环境科学学院，北京100081)

为保存中国不同民族基因组遗传资源，建立中国少数民族全基因组DNA样本库.按照临床采血标准，遵守知情同意原则，采集不同民族志愿者外周血2 mL，采用全自动核酸提取设备高通量提取DNA，经质量控制后编号入库，建立了包含545例样本的中国少数民族全基因组DNA样本库.本研究将为研究人类起源、环境与遗传背景相互作用提供物质基础，为探索疾病病因、诊断技术和治疗策略提供资源保障.

少数民族；全基因组；DNA样本库

中国是一个多民族国家，拥有世界1/5的人口，是全世界人类遗传资源最丰富的国家.复杂的进化历程，使56个民族在遗传表型及表观上存在较大的差异.中华民族呈现出丰富的人类遗传多样性，成为人类进化研究不可或缺的重要人群.人类遗传多样性是探讨人类进化与迁徙进程、环境与遗传信息交互作用、健康与致病因子的主要资源和工具.因此建立中国少数民族全基因组DNA样本库，既是研究中华民族起源、不同民族群体相互关系、环境与遗传背景相互作用的物质基础，也是促进人口健康、维护人口安全、控制重大疾病以及推动医药创新的重要资源保障[1].

本研究采用磁珠提取方法[2]，利用高通量核酸提取设备，进行全基因组DNA提取，由于人类遗传资源受到伦理学约束的特殊性，本项工作从血液样品采集到DNA样本库的建立都遵守国际和国内相关公约和法律规定，对资源信息的保密性、用户分级、信息的共享方式进行相应界定[3]，最终实现高速、高效、高质量的中国少数民族全基因组DNA样本库的建立.

1　材料和方法

1.1主要仪器

天隆磁珠核酸提取仪(NP968Eppendorf)，天隆核酸提取预封装试剂盒(Ex-DNA全血基因组3.0)，蛋白核酸测定仪(BioPhotometer Plus)，中科美菱超低温冰箱(DW-HL388)，琼脂糖凝胶电泳系统(BIO-RAD)，凝胶成像系统(BIO-RAD).

1.2 血样采集

遵从知情同意的原则，通过问卷调查，筛选3代之内无外族遗传交流的健康无遗传病史的中国各民族志愿者.按临床采血标准，采集受试者外周静脉血2 mL，按照人类遗传资源标准编码统一编号，-80 ℃低温暂存以备提取全基因组DNA.

1.3全基因组DNA提取

基于磁珠法基因组DNA提取原理，在蛋白酶K干粉中加入1 mL蛋白酶K稀释液，颠倒混匀10次，使其完全溶解，配制蛋白酶K溶液.从试剂盒中取出真空包装的预封装96孔深孔板，颠倒混匀数次使磁珠重悬，去掉真空包装，轻甩孔板，使试剂及磁珠均集中于孔板底部，小心撕去铝箔封口膜，避免孔板振动，防止液体溅出.

于96孔深孔板的槽位1、7列中分别加入200 μL血液样品、15 μL蛋白酶K溶液、60 μL核酸释放剂，程序按表1步骤进行自动化提取，自动化程序结束后，将槽位6、12列的洗脱产物移至无核酸酶离心管中，-80 ℃低温保存备用.

通过质量分数为0.6%的琼脂糖凝胶电泳，上样量4 μL，电压50 V，电泳时间40 min，鉴定提取DNA完整性.

表1　DNA提取步骤

1.4DNA浓度、纯度测定

通过蛋白核酸测定仪测定提取DNA的浓度、纯度.经质量控制，剔除浓度、纯度低样本.

1.5全基因组DNA样本库建立

将每例DNA样本分成2份，分别编号，于-80 ℃低温保存.将各个样本的DNA信息、血样提供志愿者的知情同意书、民族调查表、体检表等纸质材料整理归类编案入档保存，并将所有纸质材料整理成电子版以备查阅.

2　结果

2.1DNA 提取

共提取601例人类基因组DNA，部分DNA样本琼脂糖凝胶电泳如图1～3所示，由于DNA抽提过程中产生机械剪切力会造成DNA断裂，通常得到片段的大小都在23 kb左右，所以本研究提取DNA符合建立DNA样本库标准.

图1　部分藏族DNA样本琼脂糖凝胶电泳 图2　部分蒙古族DNA样本琼脂糖凝胶电泳 Fig.1　　　　Agarose gel electrophoresis of partial DNA sample Fig.2　Agarose gel electrophoresis of partial DNA sample of 　　　of Tibetan peopleMongolian people

图3　部分维吾尔族DNA样本琼脂糖凝胶电泳Fig.3　Agarose gel electrophoresis of partial DNA sample of Uygur people

2.2DNA浓度及纯度测定

通过核酸测定仪检测所提取DNA样本的质量浓度、纯度，剔除质量较差样本.部分样本质量浓度、纯度检测结果如表2所示，DNA样本质量浓度较高，均在60 ng/μL以上；OD260/OD280均高于1.80，表明所提取DNA中含极少量蛋白质、酚类杂质；OD260/OD230均高于2.0，表明所提取DNA几乎不受碳水化合物(糖类)、盐类或有机溶剂污染.OD340均为0，表明所提取DNA无悬浮杂质干扰.综上，所得DNA质量浓度高，样品纯，符合建立DNA样本库标准.

表2　部分DNA样本质量浓度及纯度检测结果

2.3DNA样本库建立

本研究建立了包含藏族、蒙古族、维吾尔族等37个民族及穿青人、摩梭人在内的545例样本的全基因组DNA样本库.各类样本数量、性别比例、年龄分布如表3所示，其中女性样本数量占63.85%，15～20岁的样本数量占79.45%.

表3　样本统计信息

3　讨论

人类遗传多样性体现在不同人类种族、民族群体及个体之间的基因组和表型差异.人类遗传资源是极其珍贵、不可替代的战略资源.近年来，伴随着生命科学的蓬勃发展和生物技术的日新月异，针对人类遗传资源保护、管理和应用的国际化竞争日渐激烈.因此，人类遗传资源的保护将成为决定未来各国生命科技与产业竞争成败的大本大宗[4].

中国的人类遗传多样性研究经过多年努力，从初期对人群的描述性观察，到全基因组多态位点乃至全基因组序列的扫描分析，近20多年间已取得卓越进展.通过短串联重复序列(short tandem repeat,STR)标记手段[5]，Chu等[6]分析了中国28个民族群体样本中的3个常染色体STR数据，构建了32个东亚人群系统树，证明了中国南北人群存在差异，民族群体间存在基因交流.通过单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)标记手段[7]，刘烜等[8]调查了贵州4个少数民族的Y-SNP多态性及单倍型，并分析其父系遗传结构.通过Y染色体遗传标记，Ke等[9]首先证明了东亚人起源于欧洲.之后他们又对东亚南北方40个代表群体进行了系统的SNP和STR比较分析，证明非洲起源的东亚现代人最早由东亚南部向北方迁徙[10-11].东亚大陆最早的现代人大规模由南向北的迁徙大约发生在距今6万年前，现在的东亚人群中只有少数群体保存了那次史前迁徙的遗传印记[12].另外他们还通过高密度Y-染色体单倍群及STR基因分型，构建了精细的Y染色体单倍群进，证明了东亚人群史前迁徙的“北线”假说[13].

中国少数民族基因库是研究中国人类起源、进化和迁移、民族源流及不同民族群体相互关系、环境与遗传背景相互作用的最好依据.更为重要的是，遗传多样性是肿瘤、心血管疾病、自身免疫系统疾病等多种疾病遗传易感性的生物基础，同时也是在疾病治疗中不同群体或个体对药物及生物制剂有不同反应的主要原因[14-15].因此，中国少数民族基因库在疾病基因鉴定、基因诊断和基因治疗、药物筛选等疾病防治中具有重大的现实意义，不仅可以完善中国人类遗传多样性资源的保护和利用制度，还将推进科学领域对疾病病因、诊断技术和治疗策略的研究，推动中国的生物技术飞速发展.

本研究利用高通量核酸提取设备通过磁珠法提取人类全基因组DNA，是将生物科学和纳米材料科学相结合的高新技术产品应用于中国少数民族血液样本提取和DNA样本库的建立.实验所需血液样品微量，DNA提取效率高，纯度好.本研究初步建立了中国少数民族全基因组DNA样本库，为实现中华民族遗传资源的保护奠定基础.

[1]杨昭庆，禇嘉祐.中国人类遗传多样性研究进展[J].遗传，2012,34(11)：1351-1364.DOI: 10.3724/SP.

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LIU Xuan, SHAN Keren, QI Xiaolan, et al. Y-SNP analysis of Bouyei, Gelao, Mulao, Maonan, and Zhuang populations in Guizhou[J]. Hereditas, 2006, 28(11): 1350-1354.DOI: 10.1360/yc-006-1350.

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(责任编辑：赵藏赏)

High-throughput extraction and establishment of sample bank of the genome-wide DNA of different Chinese ethnic minorities

ZHANG Yiming,WANG Junli,HUANG Jingjing,ZHANG Rongrong,PENG Yao

(College of Life and Environmental Sciences,Minzu University of China,Beijing 100081,China)

To preserve genetic resources of different Chinese ethnic groups’ genomes and establish the sample bank of the genome-wide DNA,2 mL peripheral blood was collected from each volunteer of different ethnic minorities according to the clinical blood collection standards and complying with the principle of informed consent.Automatic nucleic acid extraction machine was used to conduct high-throughput extraction of all blood samples,and the samples were numbered and put in the bank after passing quality control.The established sample bank of the genome-wide DNA includes 545 samples from ethnic minorities.The bank will provide material basis for the research of anthropogenesis and interaction of environment and genetic background;it will also serve as a resource for disease treatment and diagnostics.

ethnic minorities;genome-wide;DNA sample bank

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.02.010

2015-06-25

国家重大科学仪器设备开发专项(2012YQ03026108)；高等学校学科创新引智计划资助项目(B08044)；一流大学一流学科建设项目(YLDX01013)

张一鸣(1986-)，男，辽宁本溪人，中央民族大学在读博士研究生.E-mail：61705358@qq.com

王俊丽(1964-)，女，河北新乐人，中央民族大学教授，博士生导师，主要从事植物细胞工程及资源利用研究.

E-mail:wangjunli1698@163.com

Q39

A

1000-1565(2016)02-0169-06