一种酒精复合酶在燃料乙醇发酵中的应用效果

黄玉涛，邹婷婷，吴娟，黄丽丽，孙沛勇，刘钺

（河南天冠企业集团有限公司车用生物燃料技术国家重点实验室，河南南阳473000）

一种酒精复合酶在燃料乙醇发酵中的应用效果

黄玉涛，邹婷婷，吴娟，黄丽丽，孙沛勇，刘钺

（河南天冠企业集团有限公司车用生物燃料技术国家重点实验室，河南南阳473000）

考察了酒精复合酶KDN401在木薯粉、玉米粉和混合原料（70%小麦面浆加30%玉米）3种底物中的降残糖效果，并运用Mood中位数检验对发酵结果进行统计分析，结果表明，木薯原料乙醇发酵过程中添加酒精复合酶KDN401，对降低残糖、提高酒精度效果不显著（P＜0.05），而玉米粉和混合原料乙醇发酵过程中，添加酒精复合酶KDN401，其降糖和提高酒精度均显著（P＜0.05）。对于柔性燃料乙醇企业来说，灵活选择添加酒精复合酶，能够提高发酵质量，降低成本，从而提高企业效益。

酒精复合酶；底物；降残糖；Mood中位数检验

我国是一个生物质能源生产和应用大国，以燃料乙醇为代表的生物质能源对保障国家能源安全起到了重要作用［1］。随着我国燃料乙醇的不断推广和应用，预计到2020年燃料乙醇年利用量将达到1000万t，这对燃料乙醇原料多样性提出了更高的挑战［2］。现阶段，在燃料乙醇生产过程中，大规模应用且来源广泛的底物原料主要是玉米、小麦、薯干等粮食作物和木薯等非粮作物［3-7］，以纤维素、半纤维素为代表的二代燃料乙醇的发展仍处于小规模中试阶段，大规模生产应用短期内还不具备条件［8-10］。天冠集团是国家燃料乙醇四大定点生产厂家之一，旗下多个子公司生产变性燃料乙醇，根据工艺不同，原料底物及来源的不同，木薯、玉米、小麦均有涉及。木薯原料与玉米、小麦相比，有着淀粉含量高、成分单一、发酵残糖低的优点，缺点是缺乏营养，需要额外添加营养盐［11］，对培养基和生产管理的要求较高，否则容易造成发酵不彻底。玉米、小麦营养全面，发酵过程中无需添加营养因子，但发酵醪中含有较多酵母难利用的五碳糖、纤维素、果胶质等物质，因此发酵终了时残糖较高［12-13］。酒精复合酶KDN401是针对酒精行业而开发的特殊酶制剂，是专为提高原料利用率、增加酒精产量而设计，是一个复杂的酶系，主要成分包括纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、酸性蛋白酶和果胶酶等。它可以降解发酵醪中蛋白质，降低发酵液黏度，转化残淀粉和纤维素为葡萄糖，起到提高酒精产量的作用［14-18］。生产上，考虑到成本因素，根据KDN401在不同的原料底物中的添加效果，选择添加比例，最大程度降低企业成本，提高企业效益。本研究根据天冠集团原料和工艺实际，研究添加酒精复合酶KDN401对木薯粉、玉米粉、混合原料（70%小麦面浆加30%玉米）3种底物的应用效果，并运用Mood中位数检验［19］对发酵后的残还原糖、残总糖、酒精度指标进行统计分析，取得有统计学意义上的结论，为企业提供技术参考。

1　材料与方法

1.1实验材料

木薯粉、玉米粉、混合原料（70%小麦面浆+30%玉米粉），取自生产车间；液化酶（3万U/mL），奥谷公司；糖化酶（10万U/mL），神舟公司；酒精复合酶（KDN401），蔚蓝生物公司；干酵母，安琪公司；硫酸（工业级）；氢氧化钠（工业级）；尿素（工业级）；DK-S28电热恒温水浴锅，上海精宏；ZWY-211C恒温振荡培养箱，上海智诚公司；FL-1电炉，北京中兴伟业公司；Minitab软件等。

1.2实验方法

1.2.1木薯原料添加酒精复合酶KDN401实验

取3个1 L广口三角瓶，每瓶加入150 g木薯粉及390 g水，搅拌均匀；20%硫酸调节pH值至5.5～6.0；加入稀释100倍后的液化酶1 mL，65℃预液化0.5 h，85℃液化1.5 h；液化结束，置于冷水中快速降至常温后补水至原重；加入0.25 mL糖化酶，0.15 g尿素，0.2 g干酵母，32℃发酵。发酵24 h时，每瓶加入酒精复合酶KDN401 0.15 mL继续发酵至结束。同时另做3瓶对照。

1.2.2玉米原料添加酒精复合酶KDN401实验

同1.2.1，但配料改为每瓶加入143 g玉米粉及357 g水；液化条件改为85℃预液化1.5 h，94℃液化0.5 h。

1.2.3混合原料添加酒精复合酶KDN401实验

取3个1 L广口三角瓶，每瓶加入生产车间已调配好的混合原料培养基500 g，加入稀释成100倍后的液化酶1 mL，85℃预液化1.5 h，94℃液化0.5 h；液化结束，置于冷水中快速降至常温后补水至原重；加入0.25 mL糖化酶，0.2 g干酵母，32℃发酵。发酵24 h时，每瓶加入酒精复合酶KDN401 0.15 mL继续发酵至结束。同时另做3瓶对照。

1.3检测方法

酒度测定方法［15］：蒸馏法。还原糖、总糖的测定方法［15］：斐林试剂热滴定定糖法。酸度的测定［15］：滴定法。麦芽糖、葡萄糖、乳酸、乙酸等的测定方法：液相色谱法［16］。

2　结果与分析

2.1酒精复合酶KDN401在木薯原料燃料乙醇中的效果

如前所述，酒精复合酶KDN401作为一个复杂的酶系，主要的作用就是降解残淀粉和纤维素，供酵母二次利用，从而提高酒度，失重数据能够间接反映出酒精复合酶KDN401的作用效果，同时也能及时发现发酵过程有无异常。木薯原料燃料乙醇发酵添加酒精复合酶KDN401的失重见表1。

表1　木薯原料燃料乙醇发酵过程中添加酒精复合酶KDN401失重（g）

由表1可以看出，在木薯原料燃料乙醇发酵过程中添加酒精复合酶KDN401，整个发酵周期中，失重没有差别，各个时间节点上的失重数据都非常相近，尤其是发酵结束，二者的失重相当。而通常情况下，在发酵中后期，如果发酵醪中有较多的残淀粉和纤维素等，在酒精复合酶KDN401的作用下，会继续分解被酵母利用，失重数据会稍有增加。因此，从失重数据推断在木薯原料燃料乙醇发酵过程中添加酒精复合酶KDN401效果甚微。其常规化验结果见表2，色谱分析结果见表3。

表2　酒精复合酶KDN401在木薯原料燃料乙醇发酵中的效果（1）

表3　酒精复合酶KDN401在木薯原料燃料乙醇发酵中的效果（2）（g/100 mL）

在燃料乙醇企业生产中，根据长期生产经验及作业指导书的要求，木薯原料发酵终了指标：酸度＜6.5，乳酸含量＜0.8 g/100 mL，乙酸含量＜0.1 g/100 mL，残还原糖＜0.5 g/100 mL（酒精度在13%vol～14%vol之间），残总糖＜1.5 g/100 mL（酒精度13%vol～14%vol之间），可以认为发酵正常。从表2和表3可以看出，两组发酵正常，实验结果理想，对照组和添加组的重要指标酒精度、残还原糖、残总糖含量数据都相近。通过Minitab软件中的Mood中位数检验对酒精度、残还原糖、残总糖指标进行统计分析，结果如下：

酒精度的Mood中位数检验：卡方=0.67；DF=1；P= 0.414。

残还原糖的Mood中位数检验：卡方=0.67；DF=1；P= 0.414。

残总糖的Mood中位数检验：卡方=0.67；DF=1；P= 0.414。

从分析结果可以看出，酒精度、残还原糖、残总糖3项指标均有P＞0.05，可以认为木薯原料燃料乙醇发酵过程中添加酒精复合酶KDN401对酒度的提升没有明显效果，对残还原糖和残总糖的降低效果也不显著。这是因为木薯原料淀粉含量高，蛋白、脂肪等含量少，只要发酵正常，本身的残糖含量就很低，没有额外的残淀粉、纤维素，无法有效被酒精复合酶KDN401有效降解，因此建议在发酵中不添加，以节省成本。

2.2酒精复合酶KDN401在玉米原料燃料乙醇中的效果

玉米原料燃料乙醇发酵添加酒精复合酶KDN401的失重见表4。

由表4可以看出，相比木薯原料，玉米原料燃料乙醇发酵过程中添加酒精复合酶KDN401，在发酵后期失重有明显的变化，添加复合酶的样品平均失重要比对照样品多出2 g左右。这表明在发酵中后期，发酵醪中残存有较多的在现有生产工艺条件下难以二次降解利用的残淀粉和纤维素等，在酒精复合酶KDN401的作用下被酵母利用，因此失重数据会稍有增加。发酵结束，常规化验结果见表5，色谱分析结果见表6。

表5　酒精复合酶KDN401在玉米原料燃料乙醇发酵中的效果（1）

从表5、表6可以看出，玉米原料燃料乙醇发酵相比木薯原料其终了酸度较高，发酵过程中添加酒精复合酶KDN401后，残总糖指标由平均值2.65 g/100 mL降至1.43 g/100 mL，色谱分析中显示，发酵醪中麦芽糖的含量有了明显的下降。统计结果如下：

酒精度的Mood中位数检验：卡方=6.00；DF=1；P=0.014。

表6　酒精复合酶KDN401在玉米原料燃料乙醇发酵中的效果（2）（g/100 mL）

残还原糖的Mood中位数检验：卡方=3.00；DF=1；P= 0.083。

残总糖的Mood中位数检验：卡方=6.00；DF=1；P= 0.014。

从统计结果来看：残总糖和酒度的P＜0.05，因此可以认为，玉米原料燃料乙醇发酵过程中添加酒精复合酶KDN401能够有效的降低发酵终了残总糖水平，提高酒精度。残还原糖的统计检验显示没有显著性变化，这是因为发酵终了时发酵醪中已经没有可供酵母利用的营养物质或者检测出的还原糖成分不能够被酵母利用。

2.3酒精复合酶KDN401在混合原料燃料乙醇中的效果

混合原料燃料乙醇发酵添加酒精复合酶KDN401的失重见表7。

表7　混合原料燃料乙醇发酵过程中添加酒精复合酶KDN401失重（g）

由表7可以看出：同玉米原料相似，在发酵过程中添加酒精复合酶KDN401，后期失重有明显的变化，添加复合酶的样品平均失重比对照组大2.36 g，这表明酒精复合酶KDN401能够有效降低混合原料中的残淀粉含量。发酵结束，常规检测结果见表8，色谱分析结果见表9。

表8　酒精复合酶KDN401在混合原料燃料乙醇发酵检测结果（1）

从表8、表9可以看出，混合原料燃料乙醇发酵过程中添加酒精复合酶KDN401后，残还原糖、残总糖含量明显降低，酒精度升高，色谱分析中，麦芽糖的含量下降趋势明显。统计结果如下：

表9　酒精复合酶KDN401在混合原料燃料乙醇发酵色谱分析结果（2）（g/100 mL）

酒精度的Mood中位数检验：卡方=6.00；DF=1；P= 0.014。

残还原糖的Mood中位数检验：卡方=6.00；DF=1；P= 0.014。

残总糖的Mood中位数检验：卡方=6.00；DF=1；P= 0.014。

从统计结果来看：残还原糖、残总糖和酒精度3项指标的P＜0.05，因此可以表明，混合原料燃料乙醇发酵过程中添加酒精复合酶KDN401能够有效减少发酵终了时残还原糖、残总糖含量，提高酒精度。

3　结论

3.1在燃料乙醇生产过程中，酒精复合酶KDN401作为一种生产用辅助酶制剂，是否添加需要根据原料情况来确定。木薯原料发酵过程中由于对降低残糖，提高酒精度效果不显著，可以不添加，以节省成本；玉米粉和混合原料乙醇发酵过程中，添加酒精复合酶KDN401，其降糖和提升酒精度明显，可以根据情况适量添加以期提高发酵质量，降低原料成本。

3.2添加酒精复合酶KDN401能够在玉米和混合原料中起到降糖提高酒精度的作用，说明常规发酵结束时存在着残淀粉，液化和糖化工艺上还有很大的改进空间，生产工艺和管理对最终的发酵结果有很大的影响。

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Application of an Ethanol Compound Enzyme in the Fermentation of Fuel Ethanol

HUANG Yutao，ZOU Tingting，WU Juan，HUANG Lili，SUN Peiyong and LIU Yue
（State Key Lab of Motor Vehicle Biofuel Technology，He'nan Tianguan Enterprise Group Co.Ltd.，Nanyang，He'nan 473000，China）

In this study，the residual sugar degradation effects of alcohol compound enzyme KDN401 in three kinds of substrate（cassava flour，corn flour and mixed raw materials:70%wheat flour paste and 30%corn）were investigated.And statistical analysis of the fermentation results was performed by Mood median test.The results showed that，the addition of KDN401 in the fermentation of ethanol by cassava flour had no significant effects in reducing residual sugar and increasing alcohol content（P＞0.05），however，the addition of KDN401 in the fermentation of ethanol by corn flour/mixed raw materials had significant effects in reducing residual sugar and increasing alcohol content（P＜0.05）.Therefore，the selective addition of ethanol compound enzyme could improve fermentation quality，reduce costs，and increase the benefits for the fuel ethanol enterprise.

ethanol compound enzyme；substrate；residual sugar；Mood median test

TS262.2；TS261.4；Q815；Q819

A

1001-9286（2016）10-0067-04

10.13746/j.njkj.2016221

2016-07-06

黄玉涛（1984-），男，工程师，在职研究生，工程师，研究方向为生物能源、生物化工相关，E-mail：hnnxzdhy@sina.com。

刘钺（1977-），男，高级工程师，硕士，研究方向为生物能源、生物化工相关，E-mail：liuyue20021@sina.com。

优先数字出版时间：2016-09-14；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160914.1438.002.html。