不同株系梅鹿辄葡萄果皮酵母菌的分离鉴定与差异分析

张俊杰，杨旭，郭晨，李明阳，张文叶，刘崇怀

（1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450002；2.中国农业科学院郑州果树研究所，河南郑州450009）

不同株系梅鹿辄葡萄果皮酵母菌的分离鉴定与差异分析

张俊杰1，杨旭1，郭晨1，李明阳1，张文叶1，刘崇怀2

（1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450002；2.中国农业科学院郑州果树研究所，河南郑州450009）

研究比较和分析不同梅鹿辄葡萄株系果实表皮所蕴含的酵母菌种群的组成差异。实验选取郑州果树研究所4个梅鹿辄不同株系的葡萄作为研究对象，通过果实表皮酵母菌群的富集培养、YEPD培养基的分离与纯化，一共分离得到56个菌株；经过WL鉴别培养基的培养与菌落和显微形态观察对获得的菌株进行初步分类，得到9个具有显著差异的酵母形态群；然后对各形态群的代表菌株进行DNA提取及26S rDNAD1/D2区段的PCR扩增和测序分析，将供试菌株归入6个酵母菌种群；最后，对葡萄株系与相关酵母菌种群进行组成差异的分析，结果发现，4个梅鹿辄株系果皮上都含有的酵母菌种群为Filobasidium floriforme，而Sporidiobolus ruineniae和Hanseniaspora vineae仅为1个株系所独有，而Rhodotorula graminis（Rhodosporidium babjevae）则为2个株系所共有。由结果可以推断，由于4个株系都来自同一个品种且种植的客观环境一致，它们果皮都含有酵母菌种群Filobasidium floriforme，但是由于株系本身的不同，又分别含有不同于其他株系的特殊的酵母菌种群。研究表明，在今后的葡萄相关酵母菌研究中，要重视葡萄种群内株系间的差异，而不能只关注种群水平的组成差异。

梅鹿辄；果皮；酵母菌；分离；鉴定

葡萄是中国的重要作物之一，现今已遍布中国诸多省区［1］。据联合国粮农组织（FAO）统计，2011年中国葡萄栽培总面积59.7万hm2，居世界第4位；总产量906.7万t，居世界首位［2］。

葡萄酒发酵过程中的大多数酵母来自果皮，仅有少数来自空气。葡萄表面的野生酵母菌是最丰富的。成熟葡萄裂果流汁，促使酵母繁殖，因此成熟葡萄果粒表面附生大量酵母菌。果皮蜡质有助于这些酵母菌的附着，因此葡萄果粒破碎后不久酵母菌就会大量繁殖，出现自然发酵现象［3-4］。位于葡萄浆果表面的酵母菌种类及其数量受葡萄品种、地理位置及气候条件等诸多因素的影响［5］。

葡萄酒酿造是一个复杂的微生物学过程，是通过酵母菌的作用，将葡萄原料中糖转化为酒精。酵母菌是最重要的微生物菌群，酵母菌性能的好坏对葡萄酒产量、质量、经济性、生产管理均有较大影响，还对葡萄酒产品特色和风格的形成至关重要［6-7］。葡萄酒的酿造是通过酵母菌的作用，使原料中的各种潜在品质在酒中得以充分体现，优良的葡萄酒酵母应具有发酵性能高、耐酒精、耐糖、耐酸、耐SO2等特性［8-9］。由于不同酵母菌的作用各异，使不同的葡萄酒具有一些不同的风味特征［10］。所以用不同菌株发酵生产的葡萄酒，其酒质和风味差别很大［11］。按照酵母菌作用不同，可分为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，Sc）和非酿酒酵母（Non-Saccharomyces，NS）两大类。其中酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是葡萄酒酿造中的主要微生物，不同酵母可以赋予葡萄酒不同的品质与风味，是影响葡萄酒质量的重要因素［12-13］。所以选育有地方特色的葡萄酒优良酿酒微生物对我国葡萄酒产业的发展具有十分深远的意义［14］。

随着国外优质葡萄酒的大量进口，对中国酒类市场造成极大的冲击，也让更多的人熟知并爱上了这个酒类新宠。也让更多的人投入到葡萄酒酿造研究中，相继出现各种葡萄园，葡萄酒厂，逐步形成中国特色的葡萄酒产业。酵母菌相关的研究能让我们更清楚地了解中国各个地域的酵母菌分布，为酵母菌研究提供更多便利。中国葡萄酒酿造产业还在发展阶段，酵母菌的相关研究还有待进一步的深入研究，让酵母菌更好地发挥积极作用。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1葡萄样品的采集

实验用葡萄原料取自郑州果树研究所，采集4种梅鹿辄葡萄种植区域的共计4种葡萄各2串。当天采集当天运回实验室，于无菌条件下取葡萄表皮若干封于自封袋中，放置在-20℃下冷藏。

1.1.2培养基

①酵母菌富集培养基

酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基（YEPD）：酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，10 mg/mL氯霉素。

②分离培养基

酵母浸出粉胨葡萄糖固体培养基（YEPD）：酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂粉20 g/L。

③鉴定培养基WL

营养培养基：酵母浸粉4 g/L，胰蛋白胨5 g/L，葡萄糖50 g/L，磷酸二氢钾0.55 g/L，氯化钾0.425 g/L，氯化钙0.125 g/L，硫酸镁0.125 g/L，氯化铁0.0025 g/L，硫酸锰0.0025 g/L，琼脂20 g/L，溴甲酚绿22 mg/L。

1.1.3主要药品与试剂

酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨、葡萄糖、琼脂粉、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸锰、溴甲酚绿、DNA提取试剂盒等。

1.1.4主要设备与仪器

电热恒温培养箱、双人单面净化台、生物显微镜、恒温培养箱、电子天平、离心机、恒温水浴锅、电热鼓风干燥箱、稳压稳流电泳仪等。

1.2实验方法

1.2.1葡萄皮酵母菌富集计数

取50 mL YEPD液体培养基放入三角瓶中，经过灭菌处理后，在无菌条件下放10粒葡萄皮，再加入200 μL氯霉素液体（10 mg/mL）控制细菌生长。放置在恒温振荡培养箱中，以180 r/min、28℃培养48 h。

用1000 μL移液器吸取培养好的酵母菌液1 mL，加入提前准备好的9 mL无菌水试管中，旋涡振荡混匀，制成10-1酵母菌悬液，标上记号。按照上述方法依次稀释，制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8酵母菌稀释液。

用移液器取200 μL上述梯度稀释的酵母菌悬液均匀滴在YEPD固体培养基平板（加入氯霉素）上，再用涂布棒均匀涂布1遍，每个梯度平行涂布2个平板。涂布好的平板放置在恒温培养箱中，28℃条件下培养4～5 d。

酵母菌计数：选取菌落数在30～300个之间的稀释度（10-5）的平板进行计数，取3个平行的平均值。1 mL酵母菌悬液中酵母菌总数=平均值÷稀释度×50。

1.2.2酵母菌的分离纯化与保藏

1.2.2.1酵母菌的分离纯化

富集培养好的酵母菌进行下一步分离纯化。YEPD上不同形态的若干单菌落在WL培养基（加氯霉素）上，平板划线要确定划出单菌落。平板置于恒温培养箱中28℃培养5 d。

1.2.2.2酵母菌菌体保藏和收集

挑取酵母菌单菌落置于3 mL YEPD液体培养基试管中，在恒温摇床上180 r/min振荡、28℃培养1 d。菌液移入1.5 mL无菌离心管中，12000 r/min离心1 min，收集菌体，放置在-20℃冰箱中待用。

1.2.3酵母菌的初步鉴定

1.2.3.1酵母菌的形态学鉴定

①WL培养基上菌落形态观察：酵母菌在WL板上生长4～5 d，就可以看到酵母菌菌落形态有着显著的差别。具体从酵母菌的颜色、质地、表面特征、菌落形态等特征进行描述，对酵母菌进行形态学方面的初步分类。

②细胞显微形态观察：用10 μL移液器吸取生理盐水滴在载玻片上，再挑取菌落分散在生理盐水中制成玻片，然后进行显微观察。细胞形态描述包括3个方面：细胞形状、细胞生殖方式和细胞为单生、对生或群生。

1.2.3.2酵母菌的分子生物学鉴定

（1）菌株DNA的提取

本研究采用试剂盒法提取酵母菌基因组DNA。

（2）26S rDNADl/D2基因的扩增及测序

26S rDNAPCR扩增方法：

使用正向引物NL1（5'-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG-3'），反向引物NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）。

循环序列为：95℃预变性5 min，94℃变性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸80 s，循环次数35次，最后，72℃延伸8 min。PCR反应液组成（30µL体系）：每管中PCR缓冲液（10×）3.0 μL；25 mM MgCl21.8 μL；2.5 mM dNTPs 2.4 μL；10 μM引物各0.6 μL；5 U/μL DNA聚合酶0.6 μL，模板DNA1 μL；最后添加ddH2O定容到30 μL。

PCR反应产物的电泳检测：取0.5 μL10×上样缓冲液，再加入2 μL待检DNA溶液制成2.5 μL DNA样品。打开电源开关，电压调至100 V，电泳时间约20 min。

PCR扩增产物的测序由上海生工生物工程股份有限公司负责测序。

2　结果与分析

2.1葡萄皮酵母菌富集计数结果

对涂布过的WL平板进行酵母菌计数。经对比，选择10-5这个浓度梯度的平板进行计数，每个计数3次取平均值（表1）。

表1　葡萄皮酵母菌富集计数

由表1可以看出，酵母菌在50 mL液体培养基中的浓度无太大差别。这反映出酵母菌在4种葡萄果皮上的附着量相当。

2.2菌株的WL培养基聚类结果

根据对56株菌株做详细的菌落形态描述，对它们进行聚类分析，做出初步的归类。总共划分出9个表型，见表2。

从表型上看，它们有着或多或少的差别，从形态学上分析差别较大的可能分属于不同的属，差别较小的可能分属于不同的种。比如，在颜色上分为3种：黄色、红色、绿色，可判断它们属于不同的酵母菌菌属；而对于颜色相同具有较小差别的可以判断它们属于同种菌或者相似种。

显微观察可以更直观地观察到酵母菌的细胞上的差异。细胞形状，单生、对生或群生，繁殖方式都可以作为评判酵母种类的依据，可将菌落形态差别不大的作进一步的区分。

2.3代表性菌株WL上的形态特征和显微形态特征图片（图1）

2.426S rDNAD1/D2区段的PCR结果检测

对酵母菌菌体DNA为模板进行酶切，再用引物扩增26S rDNA基因，经1%琼脂糖凝胶电泳之后置于紫外透射检测仪上观察、拍照。

从图2可以看出，15个代表菌株的26S rDNAPCR扩增产物检测结果，右边箭头所指的即为目标条带，条带基本在一条线上，大小在600 bp左右。

2.526S rDNAD1/D2 PCR产物测序结果分析

将测序结果输入“www.NCBI.nlm.nih.gov”，利用BLAST软件，将测得的基因序列与Genbank数据库的序列进行同源性比较。选择同源性比较高的相关菌株，一般为99%或100%，并建立系统发育树，见图3。

表2　酵母菌WL培养基聚类结果

图1　各类型代表菌株在WL上的表型特征（左）和显微细胞特征（右）

图2　26SrDNAD1/D2琼脂糖凝胶电泳结果

从系统发育树上看，15个代表菌株共分6个属，分别为红酵母属（红冬酵母属）、锁掷酵母属、隐球酵母属、黑粉类酵母属、出芽短梗霉属、汉逊酵母属，其中出芽短梗霉属是一种类酵母属，而红酵母属和红冬酵母属存在极高的相似性，相似度100%，如表3最上端的2个菌种。因此15个代表菌株得到5个属的酵母菌。最终得到6个菌种：Rhodotorula graminis（Rhodosporidium babjevae）、Sporidiobolus ruineniae、Sporidiobolus pararoseus、Cryptococcus laurentii、Filobasidium floriforme、Hanseniaspora vineae。菌株和标准酵母菌的序列同源性都很高，可以确定他们同属于一种酵母菌种。

由表3可知，Filobasidium floriforme是4种葡萄所共有的，而Sporidiobolus ruineniae是②-1所独有的，Hanseniaspora vineae是②-2所独有的，Sporidiobolus pararoseus和Cryptococcus laurentii是②-4所独有的。Rhodotorula graminis（Rhodosporidium babjevae）在②-1和②-3都有出现。由表3可看出，4种葡萄果皮上酵母菌种类分布有共通之处，又有着不同之处。并且Filobasidium floriforme是4种葡萄果皮上的共有种群，表明这种酵母菌种群在梅鹿辄葡萄果皮上的共有性。

图3　代表菌株26S rDNAD1/D2系统发育树

表3　6种酵母菌种群在4种梅鹿辄葡萄果皮上的分布

3　讨论

3.1同一地域不同品种梅鹿辄葡萄果皮表面酵母菌差异

实验选取郑州果蔬研究所的4种梅鹿辄葡萄，在其表皮上分离鉴定酵母菌。实验得到5个酵母菌属，6个酵母菌种，Filobasidium floriforme为4种葡萄共有的酵母菌种，并且也是优势种群。由表2可以更直观地观察到它们的差异性。相比较实验结果，发现实验结果更偏向于片面性，10粒葡萄皮并不能够代表整串葡萄，更不能代表整株葡萄。因而，还需要作进一步的重复实验，以确保葡萄果皮酵母菌数据的完整性，为我们得出更完善的结论提供更充分的依据。再者，实验数据偏向地域性，葡萄果皮酵母菌与土壤中酵母菌种类和优势种的关系可能直接决定葡萄果皮酵母菌的种类和优势种。因此，对同一地域土壤中酵母菌的研究也是有必要的。

另外，本次试验中并没有分离出酿酒酵母，这与李双石等［2］的研究相符合，也印证了葡萄果皮并不是酿酒酵母的主要来源。

3.2WL培养基鉴别结果和分子测序结果比对

整理酵母菌菌落形态描述数据后，对它们作了聚类分析，共得到9个表型，见表2。从菌落颜色上可分为3个大种，再做细分，黄色分1种：Ⅰ表型；红色分4种：Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅸ表型；绿色分4种表型：Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ表型。从形态学上将它们分为9种酵母菌。

分子测序分析结果见图3，可以看到酵母菌分别与7个不同的酵母菌种群聚为一个系统发育分支，且相似性都为100%。整体来看，该结果与形态学上的分类结果是相符的。黄色菌落的酵母菌最终被归为一个种群，红色的菌落最终被分为3个种群，绿色的菌落最终得到3个种群。同时酵母菌种类和表型分析结果不完全一致，表明形态学上的分类仅能作为初步分类的参考，并不能准确区分不同的种群。如Ⅱ和Ⅶ表型最终属于一种菌种。对于菌种要求不高的可以选择WL鉴别培养基来作形态学上的鉴别。形态学上的鉴别比较节省时间，可以为分子测序提供便利，极大地减少了工作量。

本实验选取郑州果树研究所的4种不同梅鹿辄葡萄果皮经分离、纯化得到共计56个酵母菌株。在WL鉴别培养基上做详细的菌落形态观察和聚类分析，共分成9个形态类群。对每个形态类群分别挑选代表菌株，提取DNA，然后进行26S rDNA D1/D2区段的PCR扩增测序及系统发育分析。最终确定酵母菌归属于5个属，6个种，排除其中存在的一种霉菌属的菌群。经过分析，同一地域的4种梅鹿辄葡萄品种中总共分离得到6种酵母菌，Filobasidium floriforme是4个品种所共有的酵母菌种，而Sporidiobolus ruineniae和Hanseniaspora vineae仅为1个株系所独有，而Rhodotorula graminis（Rhodosporidium babjevae）则为2个株系所共有。由结果可以推断，由于4个株系都来自同一个品种且种植的客观环境一致，它们果皮都含有酵母菌种群Filobasidium floriforme，但是由于株系本身的不同，又分别含有不同于其他株系的特殊的酵母菌种群。该研究启示我们在今后的葡萄相关酵母菌研究中，要重视葡萄种群内株系间的差异，而不能只关注种群水平的组成差异。

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Separation&Identification of Yeasts from Pericarp of Different Merlot Grape Strains and Analysis of Their Difference

ZHANG Junjie1，YANG Xu1，GUO Chen1，LI Mingyang1，ZHANG Wenye1and LIU Chonghuai2
（1.School of Food and Bioengineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou，He'nan 450002；2.Zhengzhou Fruit Research Institute，ChineseAcademy ofAgricultural Sciences，Zhengzhou，He'nan 450009，China）

In this study，the difference in yeast population from pericarp of different Merlot grape strains was analyzed.Four strains of Merlot grape from Zhengzhou Fruit Research Institute were used as the research objects.Through enrichment culture of yeast strains，and isolation and purification of YEPD culture medium，a total of 56 yeast strains was obtained.Then after incubation in WL medium，the colony morphology and microscopic morphology were observed to make a preliminary classification of the obtained strains.As a result，nine morphological yeast groups with significant difference were found.In addition，DNA extraction，26S rDNA gene PCR amplification and sequencing of the representative strains of different morphological groups were performed.By using 26S rDNA gene phylogenetic analysis，all the representative strains could be identified as six different yeast species.Finally，the difference in yeast strains from pericarp of different grape strains was analyzed.It was found that，Filobasidium floriforme was found in all four Merlot strains，while Sporidiobolus ruineniae or Hanseniaspora vineae was only specific to only one Merlot strain and Rhodotorula graminis（Rhodosporidium babjevae）was found in two Merlot strains.It could be concluded that，the four grape strains were from the same grape species and planted under the same environment，so their pericarp all contained yeast population of Filobasidium floriforme.On the other hand，because they were different in grape strains，they contained specific yeast population in the pericarp.The study enlightened us that in the research on yeast population in grapes we should not only focus on species difference but also pay more attention to strain difference of the same species.

Merlot；pericarp；yeast；isolation；identification

TS262.6；Q93-3；TS261.1；TS261.2

A

1001-9286（2016）10-0022-05

10.13746/j.njkj.2016212

2016-06-29

张俊杰（1984-），男，博士，教授、校青年骨干教师、硕士生导师，E-mail：kirka640@163.com。

优先数字出版时间：2016-09-14；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160914.1421.001.html。