放线菌促己酸菌产己酸的促进因子探究

郭威，管健，陈茂彬，谢逾群，张玉，方尚玲

（湖北工业大学生物工程学院，工业发酵湖北省协同创新中心，湖北武汉430068）

放线菌促己酸菌产己酸的促进因子探究

郭威，管健，陈茂彬，谢逾群，张玉，方尚玲

（湖北工业大学生物工程学院，工业发酵湖北省协同创新中心，湖北武汉430068）

白酒酿造过程中某些放线菌对己酸菌产己酸有促进作用已经得到证实，但其促进机理还有待探究。本研究以Streptomyces avicenniae GW01为出发菌株，通过产酸发酵试验，最终发现放线菌所产黑色素是其促进己酸菌产己酸的促进因子。该发现首次揭示了放线菌所产黑色素与己酸菌产己酸之间存在联系，为白酒酿造微生物放线菌的研究，以及己酸菌高产己酸的研究，提供了新思路和新方向。

白酒；放线菌；己酸菌；促进因子

在白酒酿造行业中，对于放线菌，人们普遍认识不足。本实验室筛选到的1株促进己酸菌产己酸的优良放线菌Streptomyces avicenniae GW01（专利号201610104274.4），充分证实了放线菌在酿酒行业的积极作用，丰富了菌株资源，对于酿酒微生物的研究具有重要意义。白酒酿造过程中某些放线菌对己酸菌产己酸有促进作用已经得到证实，但其促进机理还有待探究。本研究以筛选到的Streptomyces avicenniae GW01为出发菌株，对其发酵液组分进行分离筛选，以期找到放线菌促己酸菌产己酸的促进因子。

1　材料与方法

1.1材料

放线菌Streptomyces avicenniae GW01（实验室筛选）；己酸菌Clostridium butyricum GK15（实验室筛选）。放线菌培养基，高氏一号培养基［1］；己酸菌培养基，巴氏合成培养基［2］；发酵培养基，巴氏合成培养基［2］。

1.2实验方法

1.2.1放线菌胞外物质对己酸菌产酸的影响

将培养成熟的Streptomyces avicenniae GW01的发酵液在12000 r/min下离心15 min，弃去菌体沉淀，取上清液，然后用0.22 μm滤膜过滤，即得到胞外液。以胞外液代替放线菌液，加入到己酸菌发酵体系中进行产己酸实验。

发酵体系各组分见表1，其他发酵条件均不变。发酵结束后，对发酵液进行硫酸铜显色和己酸含量测定。

表1　发酵实验设计

1.2.2放线菌胞外液的分离组分对己酸菌产酸的影响

胞外液的组分分离

将发酵液10000 r/min离心15 min，弃去菌体，上清液进行酸化处理，即用6 mol/L的HCl调节pH2～3，静置过夜，离心得到酸溶组分的上清液和黑色素的粗提物。

黑色素的纯化［3］

粗提物用1 mol/L的氢氧化钠溶液充分溶解，离心后，上清液再次用6 mol/L的HCl调pH2～3，静置4 h。离心，将得到的絮状沉淀物用蒸馏水洗涤至中性后干燥，再次用6 mol/L的HCl酸化4 h后，依次在有机溶剂三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇中进行抽提，最后得到的固态物质用蒸馏水清洗2～3次后，即为纯化的黑色素。

黑色素和酸溶组分对己酸菌产酸的影响

由于黑色素具有碱溶性，将放线菌所产的黑色素用NaOH溶液溶解成为pH7.6的黑色素的稀释液，代替放线菌发酵液，加入到己酸菌的发酵体系中，其他发酵条件不变。另外，再以分离的酸溶组分，其他条件不变，加入到己酸菌的发酵体系中。同时设置己酸菌单独发酵的对照实验和放线菌发酵液（离心后的上清液，后同）复配己酸菌发酵的对照实验。酸溶组分、黑色素的稀释液、放线菌发酵液均通过0.22 μm滤膜过滤后加入。发酵结束后对发酵液进行硫酸铜显色和己酸含量测定。

1.2.3黑色素的鉴定

已知上述黑色素的分离基于黑色素的溶解特性进行，即黑色素不溶于水、酸溶液和普通有机溶剂，可溶于碱溶液。在一些情况下，黑色素与糖及蛋白质结合，导致黑色素具水溶性。但对于上述放线菌所产的促己酸菌产酸的促进因子，是否属于黑色素，还需要进一步的鉴定实验。

（1）黑色素的溶解性

提纯的黑色素分成9份，每100 mL摇瓶里面加入0.01 g黑色素，以50 mL的体积分别加入酸溶液（pH3.0）、无水乙醚、无水乙醇、氯仿、丙酮、碱溶液（pH8.0）、蒸馏水、二甲基亚砜（DMSO）、甲醇到100 mL摇瓶中。50℃，150 r/min条件下振荡30 min后，再以5000 r/min离心20 min，未溶解的黑色素沉淀下来后，观察溶液的颜色，设置不加黑色素的溶液作为空白对照，在OD400nm下测吸光度。通过溶液颜色和吸光度值，对不同溶剂的黑色素的溶解性进行比较。

（2）紫外可见光吸收光谱

将纯化后的黑色素配制成NaOH稀释液。在室温下，以蒸馏水作为基线校正，用紫外可见分光光度仪在200～800 nm波长范围内进行光谱扫描。

（3）红外吸收光谱

将纯化后的黑色素用KBr压片，用红外光谱仪进行特征红外光谱分析，观察有无黑色素的特征吸收峰。于400～4000-1处扫描。

1.2.4黑色素的己酸促进水平

为了探究黑色素对己酸菌产己酸的最大促进水平，选择黑色素添加量、己酸菌接种量、培养时间、培养温度等4个重要因素，以己酸的生成量为指标，设计3水平4因素的正交试验，因素水平见表2。

表2　因素水平表

1.2.5己酸分析方法

硫酸铜显色法，参见参考文献［4］；气相色谱法，参见参考文献［5］。

2　结果与分析

2.1气相色谱法己酸含量测定

对己酸标准溶液系列进行气相色谱分析，以峰面积比对其相应质量浓度做标准曲线，建立标准己酸含量和峰面积的线性关系（图1）。

图1　GC-外标法——己酸标准曲线

由图1可知，对己酸标准曲线进行线性回归分析，己酸标准曲线的线性回归方程为y=23935x-7000000，相关系数达到了R2=0.99903，相关系数较好，可用于己酸定量检测。

2.2放线菌胞外物质对己酸菌产酸的影响（图2、图3）

由图2和图3可知，放线菌的胞外液参与己酸菌产酸发酵，硫酸铜显色明显，同时己酸定量检测表明，加入胞外液的己酸菌发酵产酸量有明显提高，其与放线菌液直接参与的己酸菌发酵相比，促酸能力相近。从结果推测，放线菌促己酸菌产己酸的促进因子可能在放线菌的胞外液中。因此，研究以放线菌胞外液为出发点，继续对放线菌促己酸菌产己酸的促进因子进行探究。

图2　放线菌胞外液作用下的硫酸铜显色结果

图3　放线菌胞外液对己酸菌产酸的影响

2.3放线菌胞外液的分离组分对己酸菌产酸的影响探究

（1）胞外液的组分分离（图4、图5）

图4　放线菌胞外液组分分离

图5　提纯的黑色素

（2）黑色素和酸溶组分对己酸菌产酸的影响（图6、图7）

图6　硫酸铜显色效果

图7　己酸含量测定

由图6和图7可以看出，加入黑色素的己酸菌产酸明显增多，表现为颜色较其他3组都深，检测出的己酸含量也最高；酸溶组分的添加没有明显效果，表现为颜色和单独己酸菌发酵时颜色相近，检测到的己酸含量和单独己酸菌的产酸量也基本持平；同时还可以看出，添加了黑色素的己酸菌产酸试验表明，硫酸铜显色程度和添加放线菌发酵液的效果相近，但从检测到的己酸含量上看，比添加放线菌发酵液的效果略好。

结合上述结果，分析可知：放线菌所产胞外黑色素，就是研究要找的促己酸菌产己酸的促进因子。

2.4黑色素的鉴定

（1）溶解特性鉴定（表3）

表3　不同溶剂的黑色素溶液颜色及吸光度

由表3可知，本试验所提取的黑色素，难溶于常见的有机溶剂（如无水乙醇、无水乙醚、氯仿、丙酮等），在水和甲醇中微溶，可溶于碱溶液和二甲基亚砜，易在酸性溶液中沉淀下来，这与国内外相关的文献报道［6-7］是一致的。

（2）紫外可见吸收光谱（图8）

图8　紫外可见吸收光谱

由图8可知，在紫外与可见光波长范围内，随着波长的逐渐增加，光密度呈下降趋势，没有特征吸收峰。该结果与相关文献［7］的报道基本一致。

（3）红外吸收光谱（图9）

图9　红外吸收光谱图

红外光谱能够表征黑色素结构的主要功能性基团。从图9可看出，黑色素在3307.21 cm-1出现吸收峰是因为O-H和吲哚的N-H的伸展振动引起的；同时由于C= O、-COO-、C=C的伸展振动导致了在1658.49 cm-1出现吸收峰，结合3307.21 cm-1出现的吸收峰，指示有-COOH结构的存在，研究学者［7］对不同来源的黑色素都做过红外光谱的研究，在上述特征峰所处位置都很接近，这说明黑色素的相关功能基团是相同的，而由于不同来源的黑色素在某些功能基团上有些差异，或是提取的黑色素纯度不同，从而导致了不同来源黑色素的波形有些差异。

综合以上各项实验结果，可以鉴定该促进因子的确是黑色素。

2.5黑色素的己酸促进水平

设计3水平4因素的正交试验，结果见表4。为了探究黑色素的己酸促进水平，选择黑色素添加量、己酸接种量、培养时间、培养温度等4个重要因素，以己酸的生成量为指标。

表4　正交试验结果

由表4分析可知，黑色素添加量对己酸生成量的影响最大，其次是己酸菌接种量，再次分别是培养温度和培养时间，其排序是黑色素添加量＞己酸菌接种量＞培养温度＞培养时间。黑色素添加量是2水平最佳，己酸菌接种量是3水平最佳，培养温度是2水平最佳，培养时间是3水平最佳，因此最优组合是A2B3C2D3，即黑色素添加量0.2 mg/100 mL，己酸菌接种量12%，33℃培养10 d，在此优化组合条件下，测得己酸生成量为5.83 g/L，比优化前提高了7.56%（表5）。

表5　黑色素的己酸促进水平

由表5可知，添加黑色素对己酸生成量影响较大。添加黑色素后己酸生成量提高了29.04%；在最佳优化条件即黑色素添加量0.2 mg/100 mL，己酸菌接种量12%，33℃培养10 d，促进水平更高，达到38.81%。

黑色素成为放线菌促己酸菌产己酸的促进因子，究其原因，可能与黑色素的功能特性有关，比如黑色素能清除自由基，免受自由基伤害，抗氧化，防止DNA的损伤；黑色素与蛋白质等结合后结构更加稳定，机械强度大大提高，蛋白质等难以被降解，从而起到了保护作用等。

3　小结与展望

为了探究放线菌促己酸菌产己酸的原因，本研究以Streptomyces avicenniae GW01为出发菌株，对其发酵液组分进行分离筛选，把分离组分加入到己酸菌发酵体系中，通过硫酸铜显色和测定己酸含量发现，加入放线菌所产黑色素的己酸菌产酸量较单独己酸菌产酸量，提高了29.04%。由此可见，放线菌所产黑色素正是促己酸菌产己酸的促进因子。通过实验也鉴定该促进因子的确是黑色素。

为了探究黑色素的己酸促进能力，进行了正交优化试验。在最佳优化条件即黑色素添加量0.2 mg/100 mL，己酸菌接种量12%，33℃培养10 d，促进水平更高，达到38.81%。

（1）放线菌所产黑色素是促己酸菌产己酸的促进因子。这一发现由于实验条件限制、时间不足等原因，具有一定的局限性。这种局限性体现在：对于本试验己酸菌之外的其他己酸菌，是否同样有促进作用以及其他来源黑色素是否同样具有促己酸菌产己酸的能力有待后续研究。虽然实验有一定的局限性，但该发现的最大意义在于首次证实了放线菌所产黑色素与己酸菌产己酸之间存在联系，为白酒酿造相关放线菌的研究，以及己酸菌高产己酸的研究，提供了新的思路。

（2）关于黑色素促己酸菌产己酸的机理也可以进一步探究。黑色素是一类抗氧化、能清除自由基的物质。关于黑色素能促己酸菌产己酸，这一结果并非偶然。例如2014年，马荣山等［8］发现在浓香型大曲酒发酵中添加维生素C，可以增加己酸含量，提高白酒品质。而维生素C和黑色素一样，也是一类抗氧化物质，均具有保护微生物生长代谢的作用，是其促己酸菌产己酸的重要原因。

（3）同维生素C相比，黑色素更加具有应用前景。这是因为维生素C本身不属于白酒酿造微生物代谢产物，而黑色素是由白酒酿造中放线菌代谢生成，这种优势是维生素C不具备的。因此后续研究可以尝试在白酒酿造环境中筛选产黑色素的优良放线菌，然后应用于白酒酿造中，有助于提高白酒香气成分和白酒品质。

［1］郑莉.环境微生物学实验［M］.广州：华南理工大学出版社，2012：57.

［2］肖冬光.白酒生产技术［M］.北京：化学工业出版社，2005：115.

［3］郑晨娜，方柏山，罗菊香，等.链霉菌G-HD-4产黑色素的提取及理化性质［J］.华侨大学学报：自然科学版，2009，30（3）：292-296.

［4］张家庆.浓香型白酒窖泥养护与制曲关键技术研究［D］.武汉：湖北工业大学，2015.

［5］冯俊旗.河南六种白酒香气成分的分析与构成规律研究［D］.新乡：河南科技学院，2013.

［6］BellAA，Wheeler M H.Biosynthesis and functions of fungal melanins［J］.Annual Review of Phytopathology，1986，24（1）：411-451.

［7］顾敏舟.一株高产黑色素菌的筛选培养及黑色素的初步研究［D］.成都：四川师范大学，2006.

［8］马荣山，曹贞.Vc在浓香型大曲发酵酒中的应用［J］.食品与发酵工业，2014（5）：98-100.

Mechanism of Actinomycetes Promoting Caproic Acid Bacteria to Produce Caproic Acid

GUO Wei，GUAN Jian，CHEN Maobin，XIE Yuqun，ZHANG Yu and FANG Shangling
（Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation，School of Biological Engineering，Hubei University of Technology，Wuhan，Hubei 430068，China）

It has been demonstrated that certain actinomycetes from liquor-making environment may promote caproic acid bacteria to produce caproic acid.However，the promotion mechanism is still unclear.In this study，Streptomyces avicenniae GW01 was used as the starting strain for acid-producing fermentation test.The results showed that melanin produced by actinomycetes was the promoting factor for the production of caproic acid.The findings revealed the correlations between melanin and caproic acid production for the first time，which provided new thoughts and new directions for the research of actinomycetes and the yield of caproic acid.

Baijiu；actinomycetes；caproic acid bacteria；promoting factor

TS262.3；TS261.1；Q93-3

A

1001-9286（2016）10-0048-05

10.13746/j.njkj.2016187

2016-05-31

郭威（1990-），男，硕士研究生，研究方向：发酵工程。

方尚玲，教授。

优先数字出版时间：2016-08-03；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160803.1034.007.html。