绿原酸等四种物质采用不同进样方法制订HPLC标准曲线的比较

焦兴苹 昝 珂 过立农 郑 健 马双成

1.青海省药品检验检测院，青海 西宁 810000；2.中国食品药品检定研究院，北京 100050



绿原酸等四种物质采用不同进样方法制订HPLC标准曲线的比较

焦兴苹 昝 珂 过立农 郑 健 马双成

1.青海省药品检验检测院，青海 西宁 810000；2.中国食品药品检定研究院，北京 100050

目的：比较高效液相色谱法制作标准曲线时，对照品稀释法和不同进样量法的异同。方法：采用高效液相色谱法，以绿原酸、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷对照品作为研究对象，采用对照品稀释法和进样不同体积法，测定峰面积，计算标准曲线。结果：木犀草苷两种方法结果线性关系良好，而绿原酸、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷仅稀释法线性关系良好。结论：建议采用稀释法测定标准曲线，不同进样量法需慎重。

高效液相色谱法；线性；对照品稀释法；不同进样量法

在建立药品质量标准时，分析方法需经验证；在药品生产工艺变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，质量标准分析方法也需进行验证。线性是药品质量标准分析方法验证的必需项目之一[1]。在建立中药含量测定方法时，高效液相色谱法是最常采用的方法。常用的标准曲线制作方法有两种，一是配置一系列浓度的标准物质，以峰面积对被测物质浓度进行线性拟合[2-8]；另外一种方法是同一对照品溶液，进样不同体积，以峰面积对被测物质进样量(μg)进行线性回归计算[9-15]。本研究采用绿原酸(1)、连翘酯苷B(2)、毛蕊花糖苷(3)、木犀草苷(4)四个对照品(结构式见图1)按上述两种线性制作方法进行试验，比较二者的异同。结果显示，4个对照品溶液按照对照品稀释法试验，线性关系均良好；采用不同进样量法试验，仅木犀草苷线性关系良好，绿原酸、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷三个化合物随进样量增大，峰面积响应值偏低，线性关系呈类抛物线型。

1 仪器与材料

1.1 仪器 安捷伦1260型高效液相色谱仪(二极管阵列检测器，二元泵，自动进样器，脱气机)；MSA125P型电子天平(赛多利斯)。1.2 材料 绿原酸对照品(批号：110753-201314)、连翘酯苷B(批号：111811-201102)、木犀草苷(批号：111720-201408)购自中国食品药品检定研究院；毛蕊花糖苷(批号：M-011-150318北京中科质检生物技术有限公司)。磷酸(批号20140305，国药集团化学试剂有限公司)，甲醇和乙腈为色谱纯(Fisher公司)，水为Milli-Q超纯水。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Waters XSelect HSS T3(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-0.5%磷酸溶液 (18∶82)；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；检测波长：332nm。

2.2 对照品溶液的配制 分别取绿原酸、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷对照品约10mg，精密称定，分别置于10mL棕色量瓶中，以乙腈溶解并定容至10mL，即得各对照品储备液。分别吸取上述储备液0.1、0.2、0.3、0.5、0.8mL分别置于25mL容量瓶中，用流动相稀释至25mL，用0.45μm滤膜过滤，取续滤液，即得对照品溶液浓度分别约为4、8、12、20、32μg/mL。

2.3 不同进样量法试验 精密吸取2.2项下对照品混合溶液(20μg/mL)，分别进样1、 2、 5、 10 、15μL，记录峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标，以相应进样量(X)为横坐标，绘制标准曲线，结果见表1，线性图见图2。

表1 对照品混合标准溶液标准曲线结果

结果表明，不同进样量法测定的木犀草苷线性关系良好，而绿原酸、连翘酯苷B和毛蕊花糖苷三个成分随进样量增大，响应值没有线性增加，呈类抛物线型。

2.3 对照品稀释法测定线性 分别精密吸取上述2.2项下一系列浓度的对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按2.1项下色谱条件测定，以各对照品进样量(μg)为X轴，以峰面积积分值为Y轴，进行线性回归，各对照品回归方程和线性范围见表2，线性图见图3。

表2 对照品稀释法制订标准曲线结果

结果表明，采用对照品稀释法，所测四个成分线性关系均良好。

3 结果与讨论

本实验采用高效液相色谱法，以绿原酸、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷以及木犀草苷四个对照品为研究对象，通过对照品稀释法和进样不同体积法对质量标准分析方法验证中的线性进行试验。结果表明，采用对照品稀释法，四个化合物的线性关系均良好，采用进样不同体积法仅木犀草苷的线性关系良好，而绿原酸、连翘酯苷B和毛蕊花糖苷三个成分随进样量增大，峰面积响应值没有线性增加，呈类抛物线型。其原因可能是流动相中加入了磷酸溶液，对照品溶液为甲醇配制，随着进样量增大，注入的不同体积的对照品溶液对流动相的pH值造成了波动。

绿原酸、连翘酯苷B和毛蕊花糖苷结构中均含有咖啡酸酯类，在含水量较高的流动相中容易产生电离，使色谱峰拖尾变宽，加入磷酸等酸性抑制剂抑制了此类化合物的电离，改善色谱峰的峰形。流动相不同pH值对化合物的峰形具有显著影响，导致峰面积不完全成线性关系[16]。而进样相同体积不同浓度的对照品溶液对流动相pH值的影响是一致的，峰面积和浓度呈线性关系。

由于本实验仪器是采用自动进样，木犀草苷的线性均良好，表明进样器准确性和性能良好。实验选用的进样量范围1～15μL为常用进样量范围，进样体积并不过大。由于不同进样量法较为简便，课题组先采用不同进样量法进行线性试验，重复3次，结果均与本文报道一致，绿原酸、连翘酯苷B和毛蕊花糖苷3个化合物线性不佳，后改用稀释法进行试验，线性良好。

因此，进行中药质量标准验证时，标准曲线的制备一般应采用稀释法进行，慎重使用不同进样体积法。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(四部)[S].北京：中国医药科技出版社，2015：374-377.

[2] 杨金铧，殷敏敏，张健，等. HPLC波长切换法测定青阳参中7个C21甾体皂苷的含量[J]. 中国药科大学学报，2014, 45(2): 200-204.

[3] 迟森森，韩丹，刘斌，等. HPLC法测定藏药宽筋藤中3个生物碱类成分的含量[J]. 药物分析杂志，2015, 35(11): 1904-1907.

[4] 陈奕君，赵薇，丁玲，等. 芳香新塔花和小新塔花全草中4个成分含量测定及聚类分析[J]. 药物分析杂志，2015, 35(11): 1908-1913.

[5] 徐皓. HPLC法测定不同产地元胡药材中5种生物碱含量[J]. 药物分析杂志，2015, 35(8): 1403-1407.

[6] 刘桂花，何承辉，邢建国，等. HPLC法同时测定复方双金感冒颗粒中3种活性成分的含量[J]. 药物分析杂志，2015, 35(8): 1441-1446.

[7] 马鸿雁，周婉珊，褚夫江，等. 苦参中黄酮类成分的高效液相指纹图谱及五种成分的含量测定[J]. 中国中药杂志，2013, 38(16): 2690-2695.

[8] 刘桂花，何承辉，邢建国，等. HPLC法同时测定复方双金感冒颗粒中3种活性成分的含量[J]. 药物分析杂志，2015, 35(8): 1441-1446.

[9] 黄志芳，易进海，陈东安，等. 制川乌HPLC特征图谱研究和6种酯型生物碱的含量测定 [J]. 药物分析杂志，2011, 31(2): 217-221.

[10]崔璐，孙小玲，郝延君，等. HPLC法同时测定前列癃闭通片中6个有效成分的含量 [J]. 药物分析杂志，2015, 35(11): 1914-1918.

[11] 罗文华，田莹莹，李新辉，等. HPLC法同时测定健儿消食口服液中毛蕊异黄酮苷、橙皮苷和黄芩苷的含量 [J]. 药物分析杂志，2015, 35(11): 1919-1923.

[12] 苏静华，张超，孙磊，等. HPLC法同时测定黄连上清片的黄芩-黄连-黄柏药对中9个指标性成分的含量 [J]. 药物分析杂志，2015, 35(11): 1940-1945.

[13] 胡益杰，刘爽，邓丽娜，等. 川木香药材HPLC指纹图谱及含量测定方法研究 [J]. 药物分析杂志，2015, 35(11): 1946-1952.

[14] 姚建标，金辉辉，王如伟，等. 银杏叶提取物中总银杏酸HPLC法限量检测 [J]. 药物分析杂志，2015, 35(11): 2041-2044.

[15] 任爽，李铮，王京辉，等. 中药女贞子饮片中8个成分的含量比较研究 [J]. 药物分析杂志，2015, 35(8): 1393-1402.

[16] 刘江云，杨学东，徐丽珍，等. 天然酚酸类化合物的反相高效液相色谱分析 [J]. 色谱，2002,20(3): 245-248.

(编辑：梁志庆)

Comparison of Four Different Chlorogenic Acid and Other Substances with Different Injection Methods to Develop HPLC Standard Curve

JIAO Xingping1ZAN Ke2GUO Linong2ZHENG Jian2*MA Shuangcheng2

1.Qinghai Provincial Institutes For Drug Control, Xining 810000，China;2.National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050,China

Object To compare differences and similarities of two injection methods for establishing calibration curves by HPLC. Methods To determine peak area and calculate calibration curves of chlorogenic acid, forsythoside B, acteoside and luteoloside by dilution and injection volume. Results Both of two methods of calibration curves are good for luteoloside. However, only dilution method can meet requirement for chlorogenic acid, forsythoside B and acteoside. Conclution Dilution method is suggested to establish calibration curves, injection volume method is suggested to use prudently.

HPLC; Calibration Curve;

ubstance Dilution Method; Injection Volume Method

2016-06-27

中医药行业科研专项“中药饮片质量保障系统研究(一)”资助，项目编号：201507002；国家食品药品监督管理总局药化注册司专项资助。

焦兴苹(1988-)，女，藏族，本科，中药师，研究方向为中藏药。E-mail：492076532@qq.com

郑健(1971-)，女，博士，研究员，研究方向为中药质量控制。E-mail：bjzj825@163.com

R914.1

A

1007-8517(2016)18-0013-04