SALL4在恶性生殖细胞肿瘤病理诊断中的应用探讨*

何　珏，彭　涛，韩巧秀，王珍玲，邓　晓，张文书

(1.赣南医学院病理学教研室；2.赣州市肿瘤医院妇瘤科，江西　赣州　341000)



SALL4在恶性生殖细胞肿瘤病理诊断中的应用探讨*

何珏1，彭涛2，韩巧秀1，王珍玲1，邓晓1，张文书1

(1.赣南医学院病理学教研室；2.赣州市肿瘤医院妇瘤科，江西赣州341000)

目的:检测SALL4在恶性生殖细胞肿瘤(malignant germ cell tumor，MGCT)中的表达，探讨其在MGCT病理诊断中的意义。方法:收集经手术切除、资料完整、来自性腺及性腺外的MGCT 80例作为研究组，其中无性细胞瘤22例，精原细胞瘤20例，卵黄囊瘤16例，未成熟性畸胎瘤12例，混合性生殖细胞肿瘤8例，胚胎性癌2例；选取同期手术切除的非生殖细胞性恶性肿瘤(No malignant germ cell tumor，NMGCT)标本40例作为对照组；应用常规病理学技术、免疫组化二步法增强型辣根酶聚合物(Polink-2HRP)染色系统，对全部120例肿瘤进行石蜡切片、HE染色和免疫组化SALL4标记，光学显微镜下观察评估。结果:MGCT的病理形态各有特点，免疫组化标记SALL4显色为核阳性，在80例MGCT中,73例为强阳性表达, 未成熟性畸胎瘤有5例弱阳性、2例阴性，总计阳性率97.5%；对照组40例NMGCT中，5例弱阳性，余阴性，阳性率12.5%；经χ2检验P<0.05，差异具有显著意义。结论:在性腺及性腺外MGCT中，以免疫组化的方法，检测干细胞标记物SALL4的表达，证实SALL4在MGCT的病理诊断中的重要作用，可为MGCT的临床诊疗提供可靠依据。

恶性生殖细胞肿瘤；SALL4；病理诊断；免疫组织化学

恶性生殖细胞肿瘤(malignant germ cell tumor，MGCT)是由原始生殖细胞和多能胚细胞转化而来的恶性肿瘤，儿童好发于0～4岁，成人好发于18～40岁。其组织类型复杂多样，包括精原细胞瘤、无性细胞瘤、卵黄囊瘤、胚胎性癌、绒毛膜癌、未成熟性畸胎瘤、混合性生殖细胞肿瘤等；主要发生在性腺器官，性腺外常发生在中线附近，如纵膈、骶尾部、腹膜后、松果体等部位[1]；大多MGCT恶性度高、进展快、易转移，治疗主要以手术切除为主，合理的放、化疗对患者的预后起着至关重要的作用，准确且及时的病理诊断是治疗效果的重要保证[2]。

MGCT的病理诊断主要依靠HE染色光学显微镜下形态学观察，由于其类型多、形态复杂多样，在临床实践中甄别难度较大，容易发生误诊[3]。为解决MGCT病理诊断中的疑难问题，笔者研习近年肿瘤分子生物学的发展趋势，参考国内外相关课题研究进展，结合临床实践设计方案，使用免疫组化半定量检测MGCT中人类婆罗双树样基因-4(Sal-like protein4，SALL4)的表达，效果良好，现报告如下。

1　资料和方法

1.1临床资料收集赣南医学院第一附属医院自2009年1月～2014年12月手术切除的符合WHO肿瘤分类及权威专著MGCT病理诊断标准[4-5]的MGCT 80例，其中来自卵巢MGCT 48例，包括无性细胞瘤22例、卵黄囊瘤14例、未成熟性畸胎瘤10例、混合性生殖细胞肿瘤2例；来自睾丸的MGCT 24例，其中精原细胞瘤16例、卵黄囊瘤2例、胚胎癌2例、混合性生殖细胞肿瘤4例；纵膈MGCT 5例，其中精原细胞瘤4例、未成熟性畸胎瘤1例；骶尾部2例，其中未成熟畸胎瘤1例，混合性MGCT 1例；颅内混合性MGCT 1例。患者男性29例，女性51例，年龄2～55岁，中位年龄36.5岁，男女比例为1∶1.76。选取同期手术切除的非生殖细胞性恶性肿瘤(No malignant germ cell tumor，NMGCT)标本40例作为对照研究，对照组均为女性，年龄17～61岁，中位年龄46岁；其中卵巢高级别浆液性癌12例、恶性Brenner瘤5例、透明细胞癌5例、粒层细胞瘤10例、淋巴瘤2例、神经内分泌癌2例，子宫弥漫性大B细胞淋巴瘤2例、高级别内膜间质肉瘤1例，腹股沟转移性无色素性黑色素瘤1例。研究组及实验组全部病例选取均符合伦理道德标准，并经赣南医学院伦理委员会批准、研究对象知情同意。

1.2研究方法全部80例MGCT及40例NMGCT均常规规范取材，4%中性甲醛固定，系列乙醇脱水，石蜡包埋，4 μm切片，苏木素-伊红(H&E)染色，光镜观察。同步采用二步法增强型辣根酶聚合物(Polink-2HRP)非生物素染色系统对全部研究肿瘤组织进行IHC标记，对组织切片常规脱蜡、水化预处理，置于3%H2O2水溶液中孵育，PBS冲洗；依次滴加一抗、聚合物增强剂，HRP聚合物，并在每次滴加试剂后37 ℃孵育1/3～2 h，PBS标准化冲洗；其后DAB显色，苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固；以PBS代替一抗为阴性对照，阳性对照为罗氏商供；标记抗体为SALL4及相关肿瘤组合抗体。

1.3IHC评价由2名以上高年资病理医生采用双盲法，依据国际标准化评价[6],经光学显微镜观察共同完成；SALL4为核阳性，以染色强度和染色范围进行综合评分；随机选取10个视野，计数200个细胞，以10%～25%为(+)，25%～50%为(++)，>50%(+++)；以棕黄色为阳性，淡黄为弱阳性，不着色为阴性。

1.4统计学方法使用统计软件SPSS 20.0对研究数据进行统计和分析，比较SALL4在MGCT与NMGCT中的表达关系，计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1MGCT的病理形态及免疫组化表达光镜下HE染色时见MGCT形态各异，无性细胞瘤由大而一致的多边形细胞构成，瘤细胞聚集成大小不等的细胞巢，周围有纤维组织分隔，瘤细胞胞质丰富，核大居中(图1)；卵黄囊瘤内多种形态混合存在，见微囊、网状、腺泡、腺管、乳头等结构，并可见内胚窦样结构，细胞异型性较大，核仁突出(图2)；胚胎性癌由原始上皮样细胞构成，呈实性巢片状，见弥漫性坏死，细胞多形性异型性明显(图3)；未成熟性畸胎瘤见数量不等的未成熟组织，极性缺失，以柱状细胞及原始小圆细胞构成的神经管为特征(图4)；混合性MGCT由2种以上的肿瘤成分构成,其内可见无性细胞瘤、精原细胞瘤、卵黄囊瘤、胚胎癌、畸胎瘤、绒癌等形态特点。经Polink-2HRP系统标记，SALL4在MGCT中IHC显色为核阳性(图5、图6、图7)；在80例MGCT中,73例肿瘤为弥漫强阳性表达, 未成熟性畸胎瘤阳性表达在幼稚的神经上皮组织(图8),其中5例弱阳性、2例阴性，总计研究组阳性率97.5%； 在40例NMGCT中，5例高级别浆液性癌呈弱阳性表达，余阴性，对照组阳性率12.5%；其表达结果见表1。

图1无性细胞瘤，细胞多边形巢状分布，胞质空淡，核仁明显，间质见淋巴细胞浸润(H&E，×200)

图2卵黄囊瘤，见卵黄囊样结构,中央为纤维及血管轴心,外周排列异型明显的肿瘤细胞(H&E，×200)

图3胚胎性癌,癌细胞排列成巢状,异型明显,核分裂多, 见大片组织坏死 (H&E，×200)

图4未成熟性畸胎瘤(G3)，见柱状细胞及原始小圆细胞构成的未成熟神经管组织，排列缺乏极性( (H&E，×200)

图5SALL4在卵黄囊瘤的瘤细胞核中弥漫性强阳表达，间质及血管阴性(Polink-2HRP，×200)

图6SALL4在无性细胞瘤的瘤细胞核中弥漫性强阳表达(Polink-2HRP，×200)

图7SALL4在胚胎癌的肿瘤细胞核中强阳表达，坏死区域不着色(Polink-2HRP，×200)

图8SALL4在未成熟性畸胎瘤的幼稚神经上皮组织中阳性表达，核阳性(Polink-2HRP，×200)

表1　SALL4在MGCT和NMGCT中的表达

注:*与对照组(NMGCT)相比P<0.05。

2.2统计学结果对实验结果采用SPSS 20.0进行处理，经两两对照分析，SALL4在研究组和对照组中的表达P<0.05，统计有差异性。

3　讨　论

MGCT是发生于性腺(睾丸、卵巢)或性腺外组织的恶性肿瘤，由原始生殖细胞和多能胚细胞转化而来；其组织类型复杂多样，可表现为精原细胞瘤、无性细胞瘤、卵黄囊瘤、胚胎性癌、绒毛膜癌、混合性生殖细胞肿瘤等等；大多发生在卵巢和睾丸，性腺外常发生在中线附近，如纵膈、骶尾部、腹膜后、松果体等部位[7]；除无性细胞瘤外，MGCT恶性度高、进展快、易转移，治疗主要以手术切除为主，合理的放、化疗对患者的预后起着至关重要的作用，准确而及时的病理诊断是有效治疗的重要保证[8]。

在临床实践中,MGCT的病理诊断主要依靠HE染色光学显微镜下形态学观察，由于其类型多、形态复杂多样，与其它类型的NMGCT形态重叠多，较易发生误诊，常需要IHC抗体标记以辅助诊断和鉴别诊断；传统免疫组化抗体主要以CK、EMA、CD117、SOX2、AFP、glypican-3、P53、Ki-67等为主，其特异性和敏感性均受客观因素影响，在临床使用中效果不够理想；为解决MGCT的病理诊断疑难，笔者结合国内外相关研究，在MGCT病理诊断中使用特异性和敏感性较强的癌基因SALL4[9]，结合传统上皮、性索间质抗体进行肿瘤基因研究，可有效弥补传统免疫组化抗体表达在特异性和敏感性方面的不足，对MGCT进行明确分类。

SALL4基因是2002年由AL-Baradie等发现的一种锌脂蛋白转录因子，是果蝇Splat(8a1)的同源异型基因，定位于人类染色体20q13，包括SALL4A 和SALL4B 两种亚型。研究证实SALL4是调控SALL基因家族表达的主要因子，可通过调节自身表达或另一转录因子OCT4表达的方式，进而调控其他SALL基因家族成员的表达；是维持胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)功能的重要调控基因，在细胞周期调控及细胞凋亡中起重要作用，SALL4可通过影响表观遗传学机制进而调控干细胞自我更新过程[10-11]。SALL4与其他转录因子包括OCT4 和SOX2等相互作用，形成复合体并与OCT-SOX元件结合，共同维持ESC的多能性。

有研究证实SALL4在卵巢畸胎瘤大部分未成熟成分中呈阳性表达，而在成熟成分中呈阴性表达； Cao等通过对睾丸肿瘤、Mei等对中枢神经系统GCT、和Wang等对性腺外卵黄囊瘤进行免疫组织化学研究发现，SALL4可成为MGCT(卵黄囊瘤、无性细胞瘤、精原细胞瘤、胚胎癌、绒毛膜癌、未成熟性畸胎瘤等)一个非常敏感而特异的标志物[12-13]。Markku M等通过对3 215例肿瘤标本的系统性免疫组化研究， 证实SALL4 是一种非畸胎瘤类生殖细胞肿瘤非常好的标志物,同样可不同程度的表达于其他肿瘤中, 比如淋巴瘤、急性白血病、肝癌、胃癌、肾母细胞瘤、恶性黑色素瘤等,这可能反映了恶性肿瘤的类干细胞分化[14-15]。

本课题以MGCT为研究对象，采用Polink-2HRP染色系统，检测MGCT中SALL4基因的表达，结果显示,SALL4在研究组80例MGCT中,73例为强阳性表达, 未成熟性畸胎瘤有5例弱阳性、2例阴性，总计阳性率97.5%；对照组40例NMGCT中，5例弱阳性，余阴性，阳性率12.5%；所选对照组NMGCT形态特点与MGCT极其相似，比如1例腹股沟转移性无色素性黑色素瘤，细胞呈大多边形,胞质透明,呈巢片状, 光学显微镜下极难与无性细胞瘤鉴别；经IHC标记，SALL4呈阴性表达,而HMB45阳性表达，为典型的恶黑免疫构型。胚胎性癌细胞异型性大,排列缺乏极性,伴大片坏死，与高级别浆液性癌及恶性Brenner瘤有较多组织学重叠，SALL4弥漫性强阳表达可以很好的鉴别。未成熟性畸胎瘤中SALL4的表达呈现不同程度的差异，阳性表达在未成熟的神经管组织,有弱阳性及阴性结果,这可能与肿瘤分化过程中的演变有一定的关系[16]。本文研究结果与文献报道吻合，但由于样本较少,未能有更多的发现。另外,本研究剔除了诊断原则独特的男性睾丸畸胎瘤，因为睾丸畸胎瘤在成年人大多为恶性，儿童大多为良性；剔除了恶性成分为上皮性肿瘤的女性恶性畸胎瘤[17]；减少了实验判断中的混乱和假阴性数据。

综上所述，在性腺及性腺外MGCT中检测SALL4的表达，可以解决MGCT临床病理诊断与鉴别诊断中的疑难问题，提高MGCT诊断的准确性，为MGCT的临床诊断和治疗提供科学依据；进而正确指导临床对手术方式进行选择，正确监测肿瘤术后复发或转移及其预后的研判；对于患者的治疗及预后指导产生科学而重要的积极影响；若能在本实验的基础上开发出MGCT相关的靶向药物，则会为医学事业的发展做出价值更大的贡献。

针对MGCT，准确、及时的诊断可为患者提供最佳的治疗方案，减少住院时间，降低医疗费用，延长患者生存期，有很好的社会及经济效益。

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The Application of SALL4 in the Pathological Diagnosis of Malignant Germ Cell Tumors

HEJue1,PENGTao2,HANQiao-xiu1,WANGZhen-ling1,DENGXiao1,ZHANGWen-shu1

(1.DepartmentofTeachingandResearch,GannanMedicalUniversity；2.DepartmentofFemaleTumor,TumorHospitalofGanzhou,GanzhouJiangxi341000)

Objectives:To study the expression of Sal-like protein4 (SALL4) in malignant germ cell tumor (MGCT) and its significance in MGCT pathological diagnosis. Methods: There were 80 cases of MGCT samples from the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University, including 22 cases of dysgerminomas, 20 cases of seminomas，16 cases of yolk sac tumors, 12 cases of immature teratomas, 8 cases of mixed germ cell tumors, and 2 cases of embryonal carcinomas, These samples were collected from January 2009 to December 2014. Fourty cases of nonmalignant germ cell tumors (NMGCT), which were removed from female bilateral ovaries in homochronous operations, were taken as the controls. Conventional pathology techniques as well as Polink-2HRP were used for paraffin embedding, HE staining, and immunohistochemistry staining of SALL4 for all 120 samples. The tissues were observed under optical microscopes. Results: Various pathological characterizations were observed for MGCT, and immunohistochemistry staining of SALL4 was positive in nucleus. In 80 cases of MGCT, 73 cases showed strongly positive in SALL4. There were 5 weak positive and 2 negative cases, and the total positive rate was 97.5% for immature MGCT. For 40 cases of controls, 5 cases were positive with weak intensity, and the rest were negative, and the positive rate was 12.5%. Under Chi-square test, the differences of SALL4 positive rates between controls and MGCT group was statistically significant(P<0.05). Conclusion:For the MGCT inside and outside of gonad, the immunohistochemistry staining of stem cell marker SALL the importance of SALL4 in the MGCT pathological diagnosis, which could provide reliable foundation for MGCT clinical diagnosis and treatment.

MGCT; SALL4; Pathological diagnosis; Immunohistochemistry

江西省教育厅科学技术研究项目(GJJ14690)

R730.2

A

1001-5779(2016)04-0580-05

10.3969/j.issn.1001-5779.2016.04.023

2016-08-18)(责任编辑：敖慧斌)