益生菌干预对芽囊原虫感染大鼠血清IL-4、IL-10、IL-12和IL-17的影响*

李小波，黄彬红，李　娟，宋　涛，邓　婷

(赣南医学院基础医学院，江西　赣州　341000)



益生菌干预对芽囊原虫感染大鼠血清IL-4、IL-10、IL-12和IL-17的影响*

李小波，黄彬红，李娟，宋涛，邓婷

(赣南医学院基础医学院，江西赣州341000)

目的:研究益生菌干预对芽囊原虫感染大鼠外周血IL-4、IL-10、IL-12和IL-17的影响，探讨益生菌、芽囊原虫感染和肠道菌群失调三者的关系。方法:48只雄性SD大鼠按三因素(益生菌干预、芽囊原虫感染和肠道菌群失调)两水平(0、1)随机分为8组。取芽囊原虫包囊液103·只-1灌胃，连续5 d，建立感染模型。用盐酸克林霉素以5 000 mg·kg-1灌胃，连续5 d，建立肠道菌群失调模型。芽囊原虫感染合并菌群失调模型在感染模型建立后用盐酸克林霉素建立。建模后1 d，金双歧2 g·d-1经口饲喂，共7 d。ELISA法检测大鼠血清IL-4、IL-10、IL-12和IL-17水平。结果:益生菌干预、芽囊原虫感染对IL-4和IL-10水平的影响均有统计学意义(P<0.05)，且益生菌干预与芽囊原虫感染之间存在交互作用(P<0.05)。益生菌干预、菌群失调对IL-12水平的影响有统计学意义(P<0.05)，益生菌干预与芽囊原虫感染，益生菌干预与菌群失调之间存在交互作用(P<0.05)。各组间IL-17水平未见显著性差异(P>0.05)。结论:芽囊原虫感染增高大鼠外周血IL-4、IL-10水平，菌群失调增高IL-12水平，合并芽囊虫感染IL-12水平较之降低，益生菌干预可改善这些细胞因子的水平。

益生菌干预；芽囊原虫感染；肠道菌群失调；IL-4；IL-10；IL-12；IL-17

芽囊原虫是寄居于人类、哺乳动物、鸟类、鼠类及爬行动物类等肠道的原生动物，在发达国家感染率约3%～5%，发展中国家感染率约为60%左右[1]。许多肠道症状与皮肤疾患都与芽囊原虫感染有关[2]。芽囊原虫感染最普遍的肠道症状为腹泻与腹痛，非特异性症状有恶心、呕吐、胀气等[2]，但其致病机制尚不清楚。

Th1/Th2失衡是感染性疾病的特征之一，在胞内菌、胞内原虫和病毒感染中表现为Th1偏移，寄生蠕虫感染表现为Th2偏移。芽囊原虫感染引起Th偏移的相关研究不多，结果也各有侧重[3-4]，实验所用虫株不同，及体内实验存在肠道菌群可能是结果不一致的原因。芽囊原虫栖居肠道，肠道中存在着大量正常菌群，芽囊原虫与肠道菌群之间是如何相互影响的？为此，本文研究益生菌干预对芽囊原虫感染大鼠外周血IL-4、IL-10、IL-12和IL-17的影响，探讨益生菌、芽囊原虫感染和肠道菌群失调三者的关系。

1　材料与方法

1.1主要实验试剂及仪器IL-4、IL-10、IL-12和IL-17 ELISA试剂盒(Cloud-Clone公司)；盐酸克林霉素胶囊(0.15 g×24 s，哈药集团三精黑河药业有限公司)；双歧杆菌乳杆菌三联活菌片(0.5 g×24 s，内蒙古双奇药业股份有限公司，含长型双歧杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌)；多功能酶标仪Varioskan Flash(Thermo公司)。

1.2虫株与包囊收集本实验使用虫株编号为HC07-12(ST1)，分离自赣南医学院第一附属医院腹泻就诊患者。此虫株在实验室保种传代，将人芽囊原虫LES培养基中的滋养体经初步离心后接种至成囊培养基，到第6天包囊成熟的高峰期用淋巴细胞分离液分离成囊培养基中的包囊。包囊经蒸馏水处理并贮于4 ℃保存，备用。

1.3动物分组及实验设计SPF级SD大鼠48只，雄性，体重(100±10) g，各组大鼠体重统计学比较无显著性差异(P>0.05)。按三因素(芽囊原虫感染、肠道菌群失调和益生菌干预)二水平(有和无)设计随机分为8组。

1.4动物模型建立与益生菌干预取芽囊原虫包囊液以103·mL-1浓度1 mL·只-1经口灌胃给接受芽囊原虫感染的大鼠，连续5 d，建立芽囊原虫感染模型。每日检查大鼠粪便，粪便中连续一星期检出人芽囊原虫空泡期或者包囊，视为感染成功。接受菌群失调处理组大鼠用盐酸克林霉素灌胃，剂量5 000 mg·kg-1，连续5 d，大鼠出现腹泻，排便次数明显增多，且粪便呈稀水样改变，达到抗生素脱污染菌群失调的程度，视为建模成功。芽囊原虫感染合并菌群失调在芽囊原虫感染后用盐酸克林霉素灌胃，剂量与时间同菌群失调组，其余各组用等量生理盐水平行操作。实验第13天金双歧2 g·d-1经口饲喂益生菌干预组大鼠，共7天，其余组平行饲喂等量灭菌生理盐水。

1.5标本采集实验20天，各组大鼠禁食24 h，禁水12 h，称重，10%水合氯醛按0.3 mL·100 g-1大鼠的标准腹腔注射。将已麻醉好的大鼠四肢固定，心脏采血3～5 mL，分离血清， ELISA 法检测大鼠血清 IL-4、IL-10、IL-12和IL-17水平。

1.6统计学方法应用SPSS 14.0统计软件进行三因素两水平方差分析。

2　结　果

各组大鼠血清IL-4、IL-10、IL-12和IL-17水平见表1。

2.1益生菌干预、芽囊原虫感染和肠道菌群失调对大鼠血清IL-4水平的影响经三因素两水平方差分析，益生菌干预、芽囊原虫感染、肠道菌群失调对大鼠血清IL-4水平的影响均有统计学意义(P<0.05)，且益生菌干预与芽囊原虫感染之间存在交互作用(P<0.05)，见图1，即益生菌干预可拮抗芽囊原虫感染导致的IL-4水平增高。

图1表明:没有益生菌干预大鼠在感染芽囊原虫后血清IL-4水平增高，进行益生菌干预后IL-4水平显著下降，益生菌干预与芽囊原虫感染之间有交互作用。

表1　各组大鼠血清IL-4、IL-10、IL-12、IL-17水平/pg·mL-1

图1　益生菌干预与芽囊原虫感染对大鼠血清IL-4水平的影响

2.2益生菌干预、芽囊原虫感染和肠道菌群失调对大鼠血清IL-10水平的影响经三因素两水平方差分析，益生菌干预、芽囊原虫感染、肠道菌群失调对大鼠血清IL-10水平的影响均有统计学意义(P<0.05)，且益生菌干预与芽囊原虫感染之间存在交互作用(P<0.05)，见图2，即益生菌干预可拮抗芽囊原虫感染导致的IL-10水平增高。

图2　益生菌干预与芽囊原虫感染对大鼠血清IL-10水平的影响

图2表明：没有益生菌干预大鼠在感染芽囊原虫后血清IL-10水平增高，进行益生菌干预后IL-10水平显著下降，益生菌干预与芽囊原虫感染之间有交互作用。

2.3益生菌干预、芽囊原虫感染和肠道菌群失调对大鼠血清IL-12水平的影响经三因素两水平方差分析，益生菌干预、菌群失调对IL-12水平的影响有统计学意义(P<0.05)，益生菌干预与芽囊原虫感染，益生菌干预与菌群失调，存在交互作用(P<0.05)，见图3和图4。

图3表明：芽囊原虫感染后IL-12水平较对照组增高，肠道菌群失调导致IL-12水平较对照组急剧增高，但芽囊原虫合并肠道菌群失调组大鼠IL-12水平较肠道菌群失调组低，两线有交叉，说明两者有交互作用，即芽囊原虫感染可部分拮抗肠道菌群失调造成的IL-12水平增高。

图4表明：肠道菌群失调造成IL-12水平显著增高，益生菌干预可改善此种改变。

图3　芽囊原虫感染与肠道菌群失调对大鼠血清IL-12水平的影响

图4　益生菌干预与肠道菌群失调对大鼠血清IL-12水平的影响

2.4益生菌干预、芽囊原虫感染和肠道菌群失调对大鼠血清IL-17水平的影响经三因素两水平方差分析，芽囊原虫感染与菌群失调均导致IL-17水平增高，但无统计学意义(P>0.05)。

3　讨　论

由于芽囊原虫分布广泛，感染率高，不仅存在于有症状人群中，在健康或无症状人群中也有分布[1]。尽管许多研究者致力于芽囊原虫的致病性研究，但至今仍有争议。

有报道认为芽囊原虫感染发生的病理生理学改变是由于触发炎症细胞因子应答及核转录因子基因表达[4-5]。Iguchi等[3]报道芽囊原虫分离株RN94-9感染大鼠诱导杯状细胞轻度增生，Th1型前炎症细胞因子显著上调。但有体外研究结果与之不符[3-4]，他们证明暴露于有症状芽囊原虫抗原的HCT116表达Th1型和Th2型细胞因子上调，提示细胞与体液免疫均被激活，但以Th2型细胞因子为主。本文研究结果表明芽囊原虫ST1株感染导致Th2型细胞因子IL-4增高，可能IL-4通过T细胞非依赖方式导致芽囊原虫感染的结肠症状，如腹泻、腹胀和腹痛等。同时抑制性细胞因子IL-10水平也增高，接受双歧杆菌乳杆菌三联活菌片干预后可以改善这种状况，Th1型细胞因子IL-12和Th17型细胞因子IL-17虽有增高的趋势，但无统计学意义。抗生素引起的肠道菌群失调组大鼠IL-12水平增高，芽囊原虫感染和益生菌干预均可降低增高的幅度。可能是由于芽囊原虫感染导致抑制性细胞因子增高，促使TH0向Th2分化，从而部分拮抗了肠道菌群失调导致的Th1型细胞因子IL-12增高。Céline Nourrisson等研究[6]发现芽囊原虫感染导致双歧杆菌明显减少。我们使用双歧杆菌乳杆菌三联活菌片干预芽囊原虫感染大鼠后改善了IL-4和IL-10的水平，可能是增加了感染大鼠肠道双歧杆菌数量的原因。

[1]Tan.New insights on classification,identification, and clinical relevance of Blastocystis spp[J].Clin Microbiol Rev,2008,21(4):639-65.

[2]Balint A,Doczi I,Bereczki L,et al.Do not forget the stool examination!-cutaneous and gastrointestinal manifestations of Blastocystis sp. infection[J].Parasitol Res，2014,113(4):1585-1590.

[3]Iguchi,Yoshikawa,Yamada,et al.Expression of interferon gamma and proinflammatory cytokines in the cecal mucosa of rats experimentally infected with Blastocystis sp. strain RN94-9[J].Parasitol Res,2009,105(1):135-40.

[4]Chan KH,Chandramathi S,Suresh K,et al.Effects of symptomatic and asymptomatic isolates of Blastocystis hominis on colorectal cancer cell line,HCT116[J].Parasitol Res,2012,110(6):2475-80.

[5]Bartlomiej Swiatczak and Maria Rescigno.How the interplay between antigen presenting cells and microbiota tunes host immune responses in the gut[J].Semin Immunol,2012,24(1):43-49.

[6]Céline Nourrisson,Julien Scanzi,Bruno Pereira,et al.Blastocystis is associated with decrease of fecal microbiota protective bacteria:comparative analysis between patients with irritable bowel syndrome and control subjects[J].PLoS One,2014,9(11):e111868.

Impact of Probiotics on the Levels of Serum Cytokine IL-4, IL-10,IL-12 and IL-17 afterBlastocystishominisInfection in Rats

LIXiao-bo,HUANGBing-hong,LIJuan,SONGTao,DENGTing

(SchoolofBasicMedicines,GannanMedicalUniversity,GanzhouJiangxi341000)

Objective: To investigate the impact of probiotics on the levels of serum cytokine IL-4、IL-10、IL-12 and IL-17 afterBlastocystishominisinfection in rats, and to explore the interaction among probiotics,B.hominisinfection, and intestinal dysbiosis. Methods:Fourty-eight SD rats were randomly assigned to 8 groups according to factorial design with three factors (probiotics,B.hominisinfection, and intestinal dysbiosis) and two levels (0 and 1). The rats in infection groups orally received 103/dayB.hominiscysts for 5 days. The rats in intestinal dysbiosis groups were orally given 5 000 mg·kg-1lincomycin hydrochloride for 5 days. The rats in mix model groups were infected withB.hominisat first 5 days and then were fed with lincomycin hydrochloride for another 5 days. The probiotics groups were fed with 2 g·d-1golden bifidobacteriums tablets for 7 days after mix models were set up. The levels of serum cytokine IL-4,IL-10,IL-12,and IL-17 were detected by ELISA. Results:Both probiotics andB.hominisinfection significantly affect the levels of serum cytokine IL-4 and IL-10(P<0.05), and there is interaction between probiotics andB.hominisinfection (P<0.05). Both probiotics and intestinal dysbiosis have significant impact on the level of serum cytokine IL-12(P<0.05),and there is interaction between probiotics and intestinal dysbiosis (P<0.05).There is no significant difference in serum IL-17 level among all groups (P>0.05).Conclusion:B.hominisinfection results in increased serum IL-4 and IL-10 levels, and intestinal dysbiosis lead to increased serum IL-12 level. However,B.hominisinfection could counteract the effect of intestinal dysbiosis in terms of IL-12 level and probiotics could balance the levels of cytokine IL-4,IL-10,and IL-12.

Probiotics;Blastocystishominisinfection; Intestinal dysbiosis; IL-4;IL-10;IL-12

江西省自然科学基金资助(20132BAB205051);江西省教育厅科学技术项目(GJJ13684)

李娟，女，副教授，主要从事消化道病原体与抗感染免疫研究。E-mail：lily_lij@163.com

R382.9

A

1001-5779(2016)04-0547-04

10.3969/j.issn.1001-5779.2016.04.013

2016-03-08)(责任编辑：敖慧斌)