利什曼原虫减毒活疫苗研究进展

【摘要】利什曼原虫减毒活疫苗因其保留了大部分免疫原性，能感染巨噬细胞，诱发与自然感染类似的免疫应答而受到众多科学家的青睐。本文综述了近年来减毒活疫苗的研究进展。

doi:10.3969/j.issn.1005-3697.2015.05.04

基金项目:国家自然科学基金(30872213)

收稿日期: 2015－07－20

作者简介:刘鹏(1990－)，男，四川南充人，硕士研究生，主要从事杜氏利什曼原虫免疫蛋白组学研究。

通讯作者:敬保迁，E-mail: bqjing@ nsmc.edu.cn

网络出版时间: 2015-10-26 17∶14

网络出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20151026.1714.008.html

Advances in the research of Leishmania live attenuated vaccine

LIU Peng，JING Bao-qian

(Institute of Immunology and Molecular Biology，North Sichuan Medical college，Nanchong 637000，Sichuan，China)

【Abstract】Leishmania live attenuated vaccines remain the most of parasitic immunogenecity and can enter into the macrophage that is similar to natural infection，which have interested many researchers.This paper reviews the study of the newest attenuated strains.

【Key words】Leishmaniasis; Genetic live attenuated vaccine; Physicochemical attenuation

利什曼原虫包含26个种株，所致利什曼病在全球98个国家传播。传统药物治疗存在费用昂贵、毒副作用、药物耐受等问题，疫苗仍是未来控制利什曼病的主要手段 ［1］。在抗利什曼病疫苗研制过程中，死疫苗虽然安全性高，但对人免疫原性低，已宣告失败 ［2］;通过皮下接种体外培养的活虫(leishmanization)也因接种处皮肤常发展成难治性皮损而被叫停 ［3］;目前虽有三个重组亚单位疫苗得到应用许可，但仅限于犬利什曼病的免疫治疗或预防 ［4］，少数重组疫苗虽进入人体I期临床试验，并表现出免疫原性，但其对人群保护率仍需进一步评价 ［5］; DNA疫苗因难以刺激产生有效的抗利什曼病免疫力，发展前景堪忧 ［6］。近年来通过基因敲除、基因过表达及其它理化方法等进行减毒的利什曼原虫活疫苗，由于它们在体内的活动与自然感染相似，有良好的免疫保护潜能，总体上安全，预示发展前景较好。现综述如下。

1　基因减毒疫苗

1.1　硕大利什曼原虫脂磷酸多糖基因敲除株

利什曼原虫表面的脂磷酸多糖(lipophosphoglycan，LGP)与磷酸多糖(phosphoglycan，PG)为原虫感染宿主细胞成份，LGP1、LGP2及LGP3基因的编码蛋白分别参与其合成。Uzonna等以敲除LGP2基因的硕大利什曼原虫感染BALB/c小鼠，发现小鼠体内长期维持低量虫荷数，并可抵抗硕大利什曼原虫野生株的攻击感染 ［7－8］。而Spath等 ［9］以该减毒10 6感染8只BALB/c小鼠，有3只在免疫125 d后出现进行性皮损，可见该减毒株存在长期毒性。并且，Thomas等 ［10］发现敲除LGP1基因的墨西哥利什曼原虫并未被减毒，进一步说明通过敲除利什曼原虫LGP基因发展减毒活疫苗的安全性存疑，其主要原因可能与不同种株原虫间LGP的表达存在差异有关 ［11］。

1.2　墨西哥利什曼原虫半胱氨酸蛋白酶基因敲除株

利什曼原虫半胱氨酸蛋白酶(cysteine proteinase，CP)包括CPA、CPB及CPC，参与原虫自噬体形成及前鞭毛体向无鞭毛体的转化 ［12］。Alexander等 ［13］以墨西哥利什曼原虫CPA与CPB基因敲除株感染BALB/c小鼠，发现CPA-株可致病，而CPB-或CPA-/CPB-株对BALB/c小鼠弱致病或不致病，与墨西哥利什曼原虫野生株感染相比，减毒株感染小鼠的免疫类型从Th2型转化成Th1型，并能抵抗墨西哥利什曼原虫野生株的攻击感染。Saravia等 ［14］以墨西哥利什曼原虫CPB -或CPA -/CPB -株感染金黄地鼠后，疾病发生延迟，而且病损减轻，虫荷下降;感染人巨噬细胞，原虫保持前鞭毛体状态，生长缓慢。并且，墨西哥利什曼原虫CPA -/CPB -株免疫金黄地鼠后，其Th2型相关细胞因子IL-10、TGF-β表达水平显著下降，对墨西哥利什曼原虫野生株攻击感染的免疫保护率可达63.6%。说明利什曼原虫半胱氨酸蛋白酶基因敲除株对小鼠、金黄地鼠及人的致病力显著减弱，具有减毒活疫苗发展前景。

1.3　婴儿利什曼原虫热休克蛋白70-II基因敲除株

热休克蛋白70(hot shock protein 70，HSP70)在原虫无鞭毛体期表达，阻止无鞭毛体内蛋白的错误折叠并参与受损蛋白的降解 ［15］。Folgueira等 ［16］敲除婴儿利什曼原虫的HSP70-II基因后，原虫形态转变成椭圆形、双鞭毛的畸形虫体。与野生株相比，其感染巨噬细胞能力不变但生存能力降低。以10 7婴儿利什曼原虫HSP70-II -株感染BALB/c小鼠，4周后，肝脏虫荷数较野生株降低1 000倍，脾脏未见原虫。Carrion等 ［17］以10 7婴儿利什曼原虫HSP70-II -株免疫5只BALB/c小鼠，4周后以硕大利什曼原虫攻击感染，除1只小鼠在感染后第七天出现约0.25 mm 2的皮损外，其它无皮损，而单纯感染硕大利什曼原虫的对照组平均皮损面积约2.5～3.0 mm 2。可见该株能产生抗野生型硕大利什曼原虫的交叉免疫保护。

1.4　杜氏利什曼原虫p27蛋白基因减毒株

p27是线粒体内膜单跨膜蛋白，细胞色素C氧化酶复合酶的组成部份，在氧化呼吸链中通过传递H +而合成ATP。由于p27是利什曼原虫无鞭毛体期特异表达蛋白，原虫通过其增加ATP合成，通过质子泵交换来抵抗巨噬细胞内酸性环境 ［18］。Dey等 ［19］以杜氏利什曼原虫p27 -/-株感染BALB/c小鼠，13周后，肝脏中虫荷约为对照组的1.25%，脾脏无原虫，16周后肝脾均无原虫，说明其毒力明显降低。以Ldp27 -/-株免疫BALB/c小鼠后，用野生型杜氏利什曼原虫攻击感染，与对照组比较，12周后实验组肝脾内虫荷数分别降低了300～10 4倍。20周后实验组肝脾内无原虫 ［20］。并且，实验组Th1型CD4 +及CD8 +T细胞数量高于对照组，将上述实验组小鼠T细胞过继转移给未经免疫的小鼠，后者亦对利什曼原虫感染产生免疫保护。Ldp27 -/-株免疫后以硕大利什曼原虫、巴西利什曼原虫攻击感染，亦存在交叉免疫保护 ［21］。

1.5　杜氏利什曼原虫类泛素折叠修饰蛋白1基因缺陷株与杜氏利什曼原虫特异性泛素折叠修饰蛋白

1蛋白酶基因缺陷株

线粒体三功能蛋白(mitochondrial tri-functional protein，MTP)是脂肪酸中氧化加水、脱氢、硫解的关键酶，杜氏利什曼原虫类泛素折叠修饰蛋白1 (Ubiquitin fold modifier1，Ufm1)活化后与MTP的α-亚基共价结合而调节线粒体脂肪酸代谢。Ufm1或特异性Ufm1蛋白酶(Ufm1-specific protease，Ufsp)缺陷后MTP活性降低，乙酰辅酶A(acetyl-CoA)合成减少，原虫生存能力降低 ［22］。Gannavaram等 ［23］完全敲除杜氏利什曼原虫Ufm1基因，发现体外培养LdUfm1 -/-株3 d后即停止增殖，乙酰辅酶A合成量低于0.5 pmol/μL，对照组高于2.5 pmol/μL。LdUfm1 -/-巨噬细胞感染率与对照组一致，但随后原虫数量逐渐降低，至第7天已无原虫。电镜下核分裂障碍，线粒体形态改变。将杜氏利什曼原虫Ufsp基因完全敲除后，亦丧失与MTP结合的能力，原虫在体外培养第5天后停止增殖，感染巨噬细胞能力下降，感染BALB/c小鼠，4周后肝脾虫荷数比野生虫株对照组分别下降100倍、20倍 ［24］。说明剔除与脂肪酸代谢相关基因的利什曼原虫具有发展减毒活疫苗的前景。

1.6　婴儿利什曼原虫细胞胞浆内沉默信息调节子

2单等位基因缺陷株

细胞胞浆内沉默信息调节子2(silent information regulatory 2，SIR2)具有NAD依耐的组氨酸去乙酰化酶活性，在基因转录沉默和DNA修复中发挥作用 ［25］。Vergnes等 ［26］发现将婴儿利什曼原虫SIR2双等位基因完全敲除后则形成致死性敲除，而将原虫SIR2单等位基因敲除后，则不影响前鞭毛体的生长，但无鞭毛体在体外巨噬细胞内和Balb/c小鼠体内增殖能力显著下降，BALB/c小鼠感染婴儿利什曼原虫LiSIR2 + /－株，8周后肝脾已无虫荷。说明SIR2基因是影响无鞭毛体增殖和生存相关基因。Silvestre等以婴儿利什曼原虫LiSIR2 + /-株免疫4只BALB/c小鼠后，用野生型婴儿利什曼原虫攻击感染10周后，全部小鼠肝脾均无原虫，对照组小鼠单纯接受婴儿利什曼原虫感染，其肝脾虫荷分别高达10 5、10 6［27］。说明婴儿利什曼原虫LiSIR2 + /－株具有发展抗内脏利什曼病减毒活疫苗的潜力。

1.7　巴西利什曼原虫小外显子基因过表达减毒株

反式剪接是锥虫科原虫基因表达调控的重要方式，其中，小外显子基因(miniexon gene)通过对动基体多顺反子前mRNA添加5＇末端，为每个mRNA分子提供5＇冒状结构促进其成熟。先前Antoniazi等 ［28］通过基因重组方式在硕大利什曼原虫内过量表达小外显子基因，发现原虫对Balb/c小鼠的毒力减低; de Toledo等将含100个拷贝的小外显子基因重组至巴西利什曼原虫，原虫能正常生长但对BALB/c小鼠及金黄地鼠致病力降低。BALB/c小鼠耳部皮下接种10 5该减毒株，在2～8周间耳与淋巴结均无虫荷; 10只金黄地鼠皮下接种10 7该减毒株后，除两只金黄地鼠出现较小皮损外，其它地鼠无皮损。Northern杂交证实上述出现皮损的两只地鼠体内的原虫不再过量表达小外显子基因 ［29］。故该减毒株虽减毒有效，但有恢复毒力的风险。

1.8　杜氏利什曼原虫中心体蛋白基因缺失株

利什曼原虫中心体蛋白(centrin protein，CP)为调节中心体复制与分裂的钙结合细胞骨架蛋白，与原虫生长密切相关 ［30］。Selvapandiyan等 ［31］以3× 10 6杜氏利什曼原虫LdCP -/-株感染BALB/c小鼠，12周后肝脾无原虫，而野生型杜氏利什曼原虫的对照组虫荷数达10 4～10 6。经杜氏利什曼原虫Ld-CP -/-株免疫接种后的BALB/c小鼠，以3×10 6野生型杜氏利什曼原虫攻击感染，12周或16周后肝脏无原虫，脾脏虫荷数较对照组降低了一半。而以杜氏利什曼原虫LdCP －/－株免疫犬后，可刺激犬产生高水平的IgG1和IgG2，高水平的淋巴细胞刺激反应，IFN-γ、TNF-α、IL-12分泌增加，IL-4分泌下降 ［32］。以婴儿利什曼原虫对免疫接种后的实验犬进行攻击感染，18个月后虫荷数下降达83.7% ［33］。说明杜氏利什曼原虫LdCP -/-株也具有发展抗内脏利什曼病减毒活疫苗的潜力。

2　物理、化学处理减毒

2.1　杜氏利什曼原虫γ射线减毒株

Datta等 ［34］以150 Gy吸收剂量的γ射线处理杜氏利什曼原虫，原虫5 d后停止生长，以该减毒株免疫小鼠后，用2×10 6野生型杜氏利什曼原虫攻击感染，120 d后小鼠肝、脾重量较对照组减轻了33%、39%，虫荷数降低了87%、88%，IFN-γ、IL-2与TNF-α比对照组分别上升了4倍、2.6倍、3.9倍;而IL-4与IL-10分别是对照组的68%、50%。说明该减毒株能刺激小鼠产生以Th1型反应为主的免疫保护力。并且，以该减毒株两次肌肉注射(间隔时间15 d)治疗小鼠内脏利什曼病，治疗后NO与超氧化物量增加了两倍，脾脏虫荷数较病鼠降低约80% ［35］。可见γ射线减毒的杜氏利什曼原虫能够预防和治疗小鼠内脏利什曼病。

2.2　婴儿利什曼原虫虽死犹活株

Brockstedt等 ［36］最初发现李斯特氏菌在uvrAB等核酸修复酶基因表达缺失状况下，以DNA交联剂补骨脂和长波紫外线进行光化学处理，细菌失去增殖能力，但短时体内代谢活性仍维持，称为虽死犹活菌(Killed but metabolically active，KBMA)。它可诱导CD4 +和CD8 +T细胞应答和保护小鼠免受病毒感染。Bruhn等 ［37］在含100 nM补骨脂衍生物S-59的培养基中培养婴儿利什曼原虫1 h，以5.4 J/cm 2紫外光照射后得到婴儿利什曼原虫KBMA株，其代谢活性可维持21 d，并能感染巨噬细胞。以该株10 7接种小鼠，2周后CD4 +T细胞、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12量与野生株感染相似; 6个月后实验组小鼠肝脾无原虫，大小正常;野生株对照组肝脏虫荷数2.6×10 7±0.6×10 7，脾中虫荷数2.0×10 7± 0.5×10 7，肝脾明显肿大。以10 7婴儿利什曼原虫KBMA株皮下免疫小鼠3次后，以10 7婴儿利什曼原虫野生株感染小鼠，对照组以生理盐水注射3次后接受原虫感染。2周和8周后实验组肝脏原虫分别约降低了0.4倍、0.6倍，说明这类利什曼原虫全细胞疫苗安全可靠，虽其对小鼠免疫保护还不甚理想，但还是显示出具有进一步研究价值 ［38］。

2.3　利什曼原虫庆大霉素减毒株(H株)

庆大霉素通过下调利什曼原虫依赖锥虫氧还蛋白过氧化物酶(tryparedoxin dependent peroxidase，LiTryP)表达，导致原虫对巨噬细胞内过氧化物清除障碍 ［39］。Daneshvar等 ［40］在含20 μg/mL庆大霉素的培养基中连续传代培养墨西哥利什曼原虫、硕大利什曼原虫、婴儿利什曼原虫、杜氏利什曼原虫至20、11、11、10代时得到减毒株(H株)前鞭毛体。墨西哥利什曼原虫H株对巨噬细胞感染率在感染后9～96 h内由53%减至0.4%，无鞭毛体的数量由98%降至2%。硕大利什曼原虫H株、婴儿利什曼原虫H株、杜氏利什曼原虫H株亦出现下降趋势。用5×10 6墨西哥利什曼原虫H株或硕大利什曼原虫H株分别皮下感染5只BLAB/c小鼠，12周后墨西哥利什曼原虫实验组的4只小鼠无皮损，1只自限性轻微皮损;硕大利什曼原虫实验组5只小鼠均无皮损。而对照组的10只小鼠均出现逐渐扩大的皮损。将婴儿利什曼原虫H株分别经静脉或皮下感染敏感实验动物犬，对照组经静脉或皮下接种野生型婴儿利什曼原虫，在观察期间实验组均无临床症状，12个月后解剖发现肝脾无病理变化，亦无虫荷，而对照组部分出现临床症状，病犬肝脾均有病理改变 ［41］。以墨西哥利什曼原虫H株或硕大利什曼原虫H株免疫小鼠后分别用硕大利什曼原虫野生株和墨西哥利什曼原虫野生株攻击感染，发现相应减毒株接种后对小鼠有显著免疫保护作用 ［40］。以婴儿利什曼原虫H株大规模免疫46只实验犬后，投放至流行区，仅一只出现临床症状，PCR检测阴性。而未经婴儿利什曼原虫H株免疫的31只实验犬，投放到流行区后，1只犬因CVL在19个月死亡，另9只犬出现临床症状，PCR检测阳性。说明婴儿利什曼原虫H株免疫实验犬可产生明显保护免疫，保护率达97.8% ［42］。

3　结语

利什曼原虫专性细胞内寄生，保护性免疫应答以细胞免疫为主。无症状感染者与利什曼病痊愈者对再次感染可产生完全免疫保护，成功研制抗利什曼病疫苗的可能性较大。减毒活疫苗具有强烈刺激细胞免疫应答潜能，但通过理化等方法进行减毒的利什曼原虫疫苗株具有毒力回复突变的潜在危险，通过对毒力基因敲除等方法进行减毒的利什曼原虫疫苗株，虽减毒稳定，但由于毒力基因的表达存在种株差异和生活史时期差异，敲除不同种株利什曼原虫同一毒力基因减毒效果迥异 ［11］。从在不同种株和生活史时期表达稳定，且对原虫生命影响较小的毒力基因中选择靶基因研制抗利什曼病减毒活疫苗显得尤为重要。