葡萄糖⁃6⁃磷酸脱氢酶的表达抑制对A431细胞增殖和细胞周期的影响

李敏 夏永华 刘冬 张孟杰 田中伟 李占国

453100河南卫辉市，新乡医学院第一附属医院皮肤科

·论著·

葡萄糖⁃6⁃磷酸脱氢酶的表达抑制对A431细胞增殖和细胞周期的影响

李敏 夏永华 刘冬 张孟杰 田中伟 李占国

453100河南卫辉市，新乡医学院第一附属医院皮肤科

目的研究葡萄糖⁃6⁃磷酸脱氢酶（G6PD）表达下调对皮肤鳞状细胞癌（鳞癌）细胞增殖和细胞周期的影响。方法正常培养人永生化上皮细胞HaCaT、皮肤鳞癌SCL⁃1和A431细胞，采用Western印迹法检测细胞中G6PD蛋白的表达。当A431细胞生长至85%～90%融合时，将siRNA对照（siRNA对照组）和G6PD siRNA（G6PD siRNA组）分别转染A431细胞，未转染的A431细胞则为未转染组。Western印迹法检测3组不同处理的A431细胞中G6PD蛋白及细胞周期蛋白D1、CDK4的表达，CCK⁃8法检测3组A431细胞的增殖情况，流式细胞仪分析3组A431细胞周期的变化。结果正常培养的2株皮肤鳞癌SCL⁃1和A431细胞中G6PD蛋白的表达水平（分别为0.308±0.023和0.643±0.046）均显著高于HaCaT细胞（0.100±0.019），且A431细胞显著高于SCL⁃1细胞（均P＜0.05）。A431细胞G6PD siRNA组G6PD、细胞周期蛋白D1和CDK4蛋白的表达（0.134±0.027、0.154±0.017、0.166±0.017）显著低于未转染组（0.425±0.029、0.344±0.024、0.330±0.020）和siRNA对照组（0.444±0.033、0.350±0.027、0.348±0.018），差异均有统计学意义（P＜0.05）。G6PD siRNA组在24～96 h各时间点的细胞增殖活性均明显低于siRNA对照组和未转染组（P＜0.001），而siRNA对照组与未转染组间细胞增殖差异无统计学意义（均P＞0.05）。G6PD siRNA组G0/G1期A431细胞比例显著高于siRNA对照组及未转染组（P＜0.001），而G6PD siRNA组S期A431细胞比例又显著低于siRNA对照组及未转染组（P＜0.001）。结论G6PD可能在调控皮肤鳞癌细胞增殖和细胞周期中发挥重要作用。

癌，鳞状细胞；葡糖磷酸脱氢酶；细胞增殖；细胞周期；A431细胞

葡萄糖⁃6⁃磷酸脱氢酶（glucose⁃6⁃phosphate dehydrogenase，G6PD）是磷酸戊糖途径的第1个关键限速酶，可催化产生5⁃磷酸核糖，用于快速增殖细胞的DNA和RNA的合成［1⁃2］，还可产生NADPH，提高肿瘤细胞的糖酵解率，增加代谢速率［3］，进而加速肿瘤的生长。研究表明，许多肿瘤中均发现G6PD的高表达，包括宫颈癌、胃癌、白血病等［4⁃6］，因此G6PD可能成为肿瘤治疗的潜在分子靶点［7］。然而，迄今为止，关于G6PD与皮肤鳞状细胞癌（鳞癌）之间的关系尚无报道。本研究旨在分析皮肤鳞癌细胞中G6PD的表达，研究其表达下调对皮肤鳞癌细胞增殖和细胞周期的影响。

材料与方法

1.实验材料：人永生化上皮细胞HaCaT［德国细胞系中心（CLS）］，皮肤鳞癌A431细胞［美国标准生物品收藏中心（ATCC）］，皮肤鳞癌细胞株SCL⁃1细胞由德国柏林自由大学本杰明·富兰克林医学中心惠赠。脂质体2000转染试剂（美国Invitrogen公司），CellCounting Kit⁃8（CCK⁃8）试剂（上海碧云天生物技术有限公司），蛋白裂解液［宝生物工程（大连）有限公司］，G6PD siRNA、siRNA对照、鼠抗人单克隆抗体G6PD、兔抗人多克隆抗体细胞周期蛋白D1和CDK4（美国Santa Cruz公司）。

2.细胞培养：HaCaT、SCL⁃1和A431细胞均培养在含10%胎牛血清、100 U/m l青霉素和100 U/ml链霉素的DMEM培养液中，置于37℃、5%CO2相对饱和的孵箱中传代培养，细胞均处于对数生长期。

3.siRNA转染及分组：A431细胞分为3组：未转染组（未转染的A431细胞）、siRNA对照组（siRNA对照转染A431细胞）和G6PD siRNA组（G6PD siRNA转染A431细胞）。当A431细胞生长至85%～90%融合时，按脂质体2000说明书将siRNA对照和G6PD siRNA分别转染A431细胞。

4.Western印迹检测G6PD蛋白及细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、CDK4的表达：收集正常培养的HaCaT、SCL⁃1和A431细胞，同时当siRNA转染A431细胞48 h后，收集3组A431细胞。采用细胞裂解液提取上述各组细胞总蛋白，进行十二烷基硫酸钠⁃聚丙烯酰胺凝胶（SDS⁃PAGE）电泳，并将凝胶上的蛋白电转移至硝酸纤维素（NC）膜上。用含5%脱脂奶粉的TBST封闭NC膜2 h，加入一抗（分别为鼠抗G6PD、细胞周期蛋白D1、CDK4和β肌动蛋白），稀释比例均为1∶200，于4℃摇床孵育过夜。加入二抗（羊抗小鼠IgG）室温孵育2 h。将NC膜置于增强化学发光试剂（ECL）中反应1～3min，于暗室中曝光，并通过显影和定影来显示特异的蛋白信号。采用Image⁃Pro Plus5.0软件分析蛋白表达的灰度值，蛋白相对表达值为目的基因与内参基因的比值，β肌动蛋白作为内参。

5.CCK⁃8检测A431细胞的增殖能力：G6PD siRNA组、siRNA对照组和未转染组A431细胞转染48 h后，制备单细胞悬液，按3 000个细胞/孔接种于96孔板中，每个时间点接种5个复孔，分别于0、24、48、72和96 h加入终浓度为10%CCK⁃8试剂，于37℃培养箱中继续孵育2～4 h，最后采用酶标仪测定其在450 nm波长处吸光度，并绘制生长曲线，评估A431细胞增殖能力的变化。

6.流式细胞仪检测A431细胞周期分布的变化：收集转染48 h后的3组A431细胞（1×106个/组）。离心后采用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗细胞3次，用70%冰乙醇于4℃固定30min，再用预冷的PBS漂洗3次，然后将细胞重悬于含40μg碘化丙啶和100μg RNaseA的PBS溶液中，于37℃孵育30min。最后利用流式细胞仪检测3组A431细胞中DNA含量。

7.统计学处理：采用SPSS17.0统计学软件，数据以±s表示，3组间差异采用单因素方差分析，各组随时间变化的趋势采用重复测量的方差分析，两两多重比较采用LSD⁃t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.G6PD蛋白在HaCaT细胞和SCL⁃1、A431细胞中的表达（图1）：Western印迹检测结果，HaCaT细胞G6PD蛋白相对表达值为0.100±0.019、SCL⁃1细胞为0.308±0.023，A431细胞为0.643±0.046，3组的表达差异有统计学意义（F=224.935，P＜0.01）。LSD⁃t检验显示，2株皮肤鳞癌细胞中G6PD蛋白的表达均显著高于HaCaT细胞（P＜0.05），且A431细胞显著高于SCL⁃1细胞（P＜0.05）。

2.G6PD siRNA显著下调A431细胞中G6PD蛋白的表达（图2）：Western印迹检测结果，G6PD siRNA组G6PD蛋白相对表达值为0.134±0.027、siRNA对照组为0.444±0.033，未转染组为0.425±0.029，3组间差异有统计学意义（F=101.316，P＜0.01）。LSD⁃t检验显示，G6PD siRNA组G6PD蛋白的表达显著低于未转染组和siRNA对照组（P＜0.05），而未转染组与siRNA对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

3.G6PD表达下调抑制A431细胞的增殖（图3）：CCK⁃8检测A431细胞增殖，3组的吸光度值经重复测量的方差分析，G6PD siRNA组、siRNA对照组及未转染组差异有统计学意义（F组别=215.032，P＜0.001），各组吸光度值随时间的延长而增加（F时间=536.203，P＜0.001），组别与作用时间有交互作用（F交互=6.576，P=0.008）。LSD⁃t检验显示，24、48、72、96 h时，G6PD siRNA组A431细胞增殖的吸光度值明显低于siRNA对照组和未转染组（P＜0.001），而siRNA对照组与未转染组间在各个时间点差异均无统计学意义（P＞0.05）。

图1 Western印迹法检测HaCaT、SCL⁃1和A431细胞中G6PD蛋白的表达SCL⁃1细胞和A431细胞G6PD蛋白条带灰度均高于HaCaT细胞，A431细胞高于SCL⁃1细胞；β肌动蛋白为内参照

图2 Western印迹法检测3个不同处理组A431细胞中G6PD蛋白的表达转染48 h后，G6PD siRNA组G6PD蛋白条带灰度明显低于未转染组和siRNA对照组，而siRNA对照组与未转染组间无明显差异

图3 G6PD表达下调对皮肤鳞癌A431细胞增殖的影响24、48、72、96 h时，与未转染组及siRNA对照组相比，G6PD siRNA组A431细胞增殖吸光度值均不同程度降低，而未转染组与siRNA对照组细胞增殖无明显差异

表1 G6PD表达下调对3组A431细胞周期分布及细胞周期相关蛋白表达的影响（±s）

表1 G6PD表达下调对3组A431细胞周期分布及细胞周期相关蛋白表达的影响（±s）

注：n=3

组别G6PD siRNA组siRNA对照组未转染组F值P值A431细胞周期分布（%）G0/G1期65.33±0.95 54.36±1.32 52.94±0.74 130.158＜0.001 S期21.66±1.60 28.22±0.88 28.99±0.48 40.812＜0.001 G2/M期13.01±0.86 17.42±0.58 18.07±0.64 45.764＜0.001细胞周期相关蛋白周期蛋白D1 0.154±0.017 0.350±0.027 0.344±0.024 70.136＜0.001 CDK4 0.166±0.017 0.348±0.018 0.330±0.020 91.523＜0.001

4.G6PD表达下调对A431细胞周期的影响（表1）：G6PD siRNA组、siRNA对照组及未转染组处于G0/G1期、S期及G2/M期的A431细胞比例差异均有统计学意义。LSD⁃t检验显示，G6PD siRNA组G0/G1期A431细胞比例高于siRNA对照组及未转染组，差异有统计学意义（P＜0.001），而S期细胞比例低于siRNA对照组及未转染组，差异有统计学意义（P＜0.001）。

5.G6PD表达下调对cyclin D1和CDK4表达的影响（表1、图4）：G6PD siRNA组、siRNA对照组及未转染组间cyclin D1、CDK4表达水平差异均有统计学意义。LSD⁃t检验显示，G6PD siRNA组cyclin D1、CDK4蛋白表达水平均明显低于siRNA对照组和未转染组，差异均有统计学意义（P＜0.001），而siRNA对照组与未转染组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。

讨论

代谢途径的重编程是肿瘤典型的特征之一。

图4 Western印迹法检测G6PD siRNA组、siRNA对照组及未转染组A431细胞中细胞周期蛋白D1（cyclin D1）和CDK4的表达转染48 h后，G6PD siRNA组cyclin D1及CDK4蛋白条带灰度均明显低于siRNA对照组及未转染组，而siRNA对照组与未转染组间2种细胞周期蛋白条带灰度无明显差异；β肌动蛋白为内参照研究表明，大量的代谢途径牵涉到肿瘤的发生和进展［8⁃9］，其中磷酸戊糖途径作为潜在的肿瘤治疗干预靶点而备受关注［10］。G6PD调控磷酸戊糖途径对于维持细胞的氧化还原平衡和核酸等的合成发挥重要作用［7］。研究表明，G6PD在胃癌［5］、膀胱癌组织［11］中的表达水平显著高于正常组织，在乳腺癌组织［12］中的表达水平高于其良性病变组织。我们的前期研究［13］表明，G6PD与皮肤鳞癌细胞的凋亡和侵袭能力密切相关。本研究中我们发现，2株皮肤鳞癌SCL⁃1和A431细胞中G6PD蛋白的表达水平均显著高于HaCaT细胞，表明G6PD可能在维持肿瘤细胞的恶性表型中发挥重要作用。

研究［14］表明，G6PD在促进恶性肿瘤细胞的存活和增殖中发挥重要作用。Du等［15］发现，转染G6PD siRNA的骨肉瘤细胞株（U2OS）或TAp73+/+小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）产生的肿瘤较小，但重新引入G6PD能引发TAp73+/+MEF细胞的快速增殖。重新过表达G6PD能使TAp73敲除引发的细胞增殖抑制得以恢复［16］。研究还发现，G6PD敲除的A375细胞增殖能力明显减弱［17］，表明G6PD是一种重要的细胞增殖调控因子。本研究显示，G6PD siRNA转染A431细胞48 h后，G6PD蛋白的表达水平显著下降，且在转染48 h后及后续的各个时间点，A431细胞的增殖显著受到抑制，提示G6PD表达水平的下调能引发皮肤鳞癌细胞的增殖抑制。因此，G6PD可能成为调控皮肤鳞癌细胞增殖的分子靶点，未来G6PD是否真正能够成为分子靶点尚需进一步通过裸鼠移植瘤观察其对增殖的效果，并分析裸鼠移植瘤中相关增殖指标如Ki⁃67等表达以及增殖相关信号途径的变化，进一步从分子水平认识G6PD在皮肤鳞癌中的作用及其分子机制，从而为G6PD的快速临床转化奠定基础。

细胞周期主要由细胞周期相关蛋白来调控，其中cyclin D1⁃CDK4途径是最重要的途径之一，是细胞周期从G1期向S期过渡的中心调节子［18⁃19］。本研究证实，G6PD表达的下调能诱导A431细胞周期阻滞在G0/G1期，并显著下调相应的细胞周期蛋白cyclin D1和CDK4的表达，提示G6PD可能通过cyclin D1⁃CDK4途径调控A431细胞周期分布的变化。

总之，本研究结果表明，G6PD蛋白在皮肤鳞癌A431细胞中高表达，其表达下调可明显抑制细胞的增殖，使细胞周期阻滞在G0/G1期，并显著下调细胞周期相关蛋白cyclin D1和CDK4的表达。尽管目前的结果初步提示G6PD可能成为皮肤鳞癌的潜在分子治疗靶点，但本研究尚欠缺的是需要大量地增加皮肤鳞癌的数量，从而保证其结果的可靠性和准确性，进而从多种不同的细胞中详细探讨G6PD的分子调控机制，为皮肤鳞癌的诊断和治疗提供新的理论依据。

［1］Kuo W,Lin J,Tang TK.Human glucose⁃6⁃phosphate dehy⁃drogenase（G6PD）gene transforms NIH 3T3 cells and induces tumors in nudemice［J］.Int JCancer,2000,85（6）:857⁃864.

［2］Boros LG,Puigjaner J,Cascante M,et al.Oxythiamine and dehydroepiandrosterone inhibit the nonoxidative synthesis of ribose and tumor cell proliferation［J］.Cancer Res,1997,57（19）:4242⁃4248.

［3］Gatenby RA,Gillies RJ.Why do cancers have high aerobic glycolysis?［J］.Nat Rev Cancer,2004,4（11）:891⁃899.DOI:10.1038/nrc1478.

［4］Hu T,Li YS,Chen B,et al.Elevated glucose⁃6⁃phosphate dehydrogenase expression in the cervical cancer cases is associated with the cancerigenic event of high⁃risk human papillomaviruses［J］.Exp Biol Med（Maywood）,2015,240（10）:1287⁃1297.DOI:10.1177/1535370214565971.

［5］Wang J,Yuan W,Chen Z,et al.Overexpression of G6PD is associated with poor clinical outcome in gastric cancer［J］.Tumour Biol,2012,33（1）:95⁃101.DOI:10.1007/s13277⁃011⁃0251⁃9.

［6］TsukamotoN,Chen J,YoshidaA.Enhanced expressionsofglucose⁃6⁃phosphate dehydrogenase and cytosolic aldehyde dehydro⁃genase and elevation of reduced glutathione level in cyclophosphamide⁃resistant human leukemia cells［J］.Blood Cells Mol Dis,1998,24（2）:231⁃238.DOI:10.1006/bcmd.1998.0188.

［7］Zhang C,Zhang Z,Zhu Y,et al.Glucose⁃6⁃phosphate dehydrogenase:a biomarker and potential therapeutic target for cancer［J］.Anticancer Agents Med Chem,2014,14（2）:280⁃289.DOI:10.2174/18715206113136660337.

［8］Boroughs LK,DeBerardinis RJ.Metabolic pathways promoting cancer cell survival and growth［J］.Nat Cell Biol,2015,17（4）:351⁃359.DOI:10.1038/ncb3124.

［9］Furuta E,Okuda H,Kobayashi A,et al.Metabolic genes in cancer:their roles in tumor progression and clinical implications［J］.Biochim Biophys Acta,2010,1805（2）:141⁃152.DOI:10.1016/j.bbcan.2010.01.005.

［10］Jones NP,Schulze A.Targeting cancermetabolism⁃⁃aiming at a tumour′ssweet⁃spot［J］.Drug Discov Today,2012,17（5⁃6）:232⁃241.DOI:10.1016/j.drudis.2011.12.017.

［11］Ohl F,Jung M,Radonic A,et al.Identification and validation of suitable endogenous reference genes for gene expression studies ofhuman bladder cancer［J］.JUrol,2006,175（5）:1915⁃1920.DOI:10.1016/S0022⁃5347（05）00919⁃5.

［12］Bokun R,Bakotin J,Milasinovic D.Semiquantitative cytochemical estimation of glucose⁃6⁃phosphate dehydrogenase activity in benign diseases and carcinoma of the breast［J］.Acta Cytol,1987,31（3）:249⁃252.

［13］李敏,夏永华,刘冬,等.葡萄糖6磷酸脱氢酶表达下调对皮肤鳞癌细胞系A431细胞凋亡和侵袭能力的影响［J］.中华病理学杂志,2016,45（1）:49⁃50.DOI:10.3760/cma.j.issn.0529⁃5807.2016.01.012.Li M,Xia YH,Liu D,et al.Effects of inhibition of G6PD expression on cell proliferation and cell cycle in cutaneous squamous cell carcinoma A431 cells［J］.Chin JPathol,2016（1）:49⁃50.DOI:10.3760/cma.j.issn.0529⁃5807.2016.01.012.

［14］Manganelli G,Masullo U,Passarelli S.Glucose⁃6⁃phosphate dehydrogenase deficiency:disadvantages and possible benefits［J］.Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets,2013,13（1）:73⁃82.DOI:10.2174/1871529X11313010008.

［15］Du W,Jiang P,Mancuso A,et al.TAp73 enhances the pentose phosphate pathway and supports cell proliferation［J］.Nat Cell Biol,2013,15（8）:991⁃1000.DOI:10.1038/ncb2789.

［16］Jiang P,Du W,Yang X.A critical role of glucose⁃6⁃phosphate dehydrogenase in TAp73⁃mediated cell proliferation［J］.Cell Cycle,2013,12（24）:3720⁃3726.DOI:10.4161/cc.27267.

［17］Hu T,Zhang C,Tang Q,etal.VariantG6PD levels promote tumor cell proliferation or apoptosis via the STAT3/5 pathway in the humanmelanoma xenograftmousemodel［J］.BMCCancer,2013,13:251.DOI:10.1186/1471⁃2407⁃13⁃251.

［18］Rao RN.Targets for cancer therapy in the cell cycle pathway［J］.CurrOpin Oncol,1996,8（6）:516⁃524.

［19］Tashiro E,Tsuchiya A,Imoto M.Functions of cyclin D1 as an oncogene and regulation of cyclin D1 expression.Cancer Sci,2007,98（5）:629⁃635.DOI:10.1111/j.1349⁃7006.2007.00449.x.

Effects of inhibition of glucose⁃6⁃phosphate dehydrogenase expression on proliferation and cell cycle distribution of A431 cells

LiMin,Xia Yonghua,Liu Dong,Zhang Mengjie,Tian Zhongwei,LiZhanguo
DepartmentofDermatology,FirstAffiliated HospitalofXinxiang MedicalUniversity,Xinxiang 453100,Henan,China

Tian Zhongwei,Email:zhonwt@xxmu.edu.cn

Objective To evaluate effects of downregulation of glucose⁃6⁃phosphate dehydrogenase（G6PD）expression on proliferation and cell cycle distribution of cutaneous squamous cell carcinoma（CSCC）cells.Methods Western blot analysis was performed tomeasure the protein expression of G6PD in normally cultured human HaCaT keratinocytes,SCL⁃1 and A431 CSCC cells.When A431 cells grew to 85%-90%confluence,a small interfering RNA（siRNA）targeting G6PD（G6PD⁃siRNA group）and anegative control siRNA（siRNA controlgroup）were transfected into them separately,and untransfected A431 cells served as the untransfected group.CCK⁃8 assay was performed to evaluate proliferative activity of the A431 cells on days 0,1,2,3 and 4 after transfection,Western blot analysis to measure G6PD,cyclin D1 and CDK4 protein expressions in A431 cells,and flow cytometry to analyze cell cycle distribution in A431 cells after 48 hours of additional culture.Results The protein expression of G6PD was significantly higher in normally cultured SCL⁃1 cells（0.308±0.023）and A431 cells（0.643±0.046）than in HaCaT cells（0.100±0.019,bothP＜0.05）,and significantly higher in A431 cells than in SCL⁃1 cells（P＜0.05）.TheG6PD⁃siRNA group showed significantly decreased protein expressionsofG6PD,cyclin D1 and CDK4（0.134±0.027,0.154±0.017 and 0.166±0.017,respectively）compared with the untransfected group（0.425±0.029,0.344±0.024 and 0.330±0.020 respectively）and siRNA controlgroup（0.444±0.033,0.350±0.027 and 0.348±0.018 respectively）（allP＜0.05）.Besides,the G6PD⁃siRNA group showed significantly decreased cellular proliferative activity on days 1-4 compared with the siRNA control group and untransfected group（allP＜0.001）,while therewere no significant differences between the untransfected group and siRNA control group at any of the time points（allP＞0.05）.Compared with the untransfected group and siRNA control group,the G6PD⁃siRNA group showed significantly higher proportions of A431 cells in G0/G1 phase（bothP＜0.001）,but significantly lower proportions of A431 cells in S phase（bothP＜0.001）.Conclusion G6PDmay play important roles in the regulation of proliferation and cell cycle distribution ofCSCC cells.

Carcinoma,squamous cell;Glucosephosphate dehydrogenase;Cell proliferation;Cell cycle;A431 cells

田中伟，Email：zhonwt@xxmu.edu.cn

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2016.11.02

2016⁃02⁃03）

（本文编辑：周良佳颜艳）