部分茶竿竹亚属竹种亲缘关系的ITS序列分析

钟　浩，高贵宾，吴良如，*

(1. 国家林业局竹子研究开发中心，浙江 杭州 310012；2. 浙江省竹子高效加工重点实验室，浙江 杭州 310012)



部分茶竿竹亚属竹种亲缘关系的ITS序列分析

钟浩1，2，高贵宾1，2，吴良如1，2，*

(1. 国家林业局竹子研究开发中心，浙江 杭州 310012；2. 浙江省竹子高效加工重点实验室，浙江 杭州 310012)

为了探讨怀集县铁厘茶竿竹和白水茶竿竹与其他茶竿竹亚属竹种之间在分子水平上的差异以及它们的分类地位，对包括铁厘茶竿竹和白水茶竿竹在内的9个茶竿竹亚属竹种的核糖体基因(nrDNA)的内转录间隔区(ITS)序列进行分析，并构建系统进化树。结果表明，所有供试材料ITS全长在559～648 bp，(G+C)含量变化范围为46.02%～57.65%，其中铁厘茶竿竹和白水茶竿竹ITS全长分别为559 bp和614 bp，(G+C)含量分别为55.64%和57.65%。ITS序列构建的系统进化树显示：正种茶竿竹及其变种聚为一个大支，其中铁厘茶竿竹和白水茶竿竹聚在一起。以上结果佐证了铁厘茶竿竹和白水茶竿竹是正种茶竿竹的2个变种。

正种茶竿竹；ITS；系统进化树

正种茶竿竹(Pseudosasaamabilis)，属禾本科竹亚科(Bambusoideae Nees)矢竹属(Pseudosasa)茶竿竹组的模式种[1]，是我国特产的珍贵竹种之一，竹秆通直、节平、壁厚、光滑、坚韧、材质优良，可制作各种竹器家具、雕刻装饰、钓鱼竿、滑雪杖、旗竿、篱笆等。竹材纤维含量达53.2%，适于造纸和制人造丝浆[2]。正种茶竿竹主产于江西、福建、湖南、广东、广西等省区，近年，江苏、浙江省有引种栽培，模式标本采自广东广宁[1]，生于丘陵平原或河流沿岸的山坡。

中国植物志记载，茶竿竹亚属有16种5变种[1]，均分布在我国华南、华东地区之南部，而徐英宝等[2]报道，怀集县有3个变种，即正种茶竿竹(var.amabilis)、铁厘茶竿竹(var.ferrea)和白水茶竿竹(var.peshuiensis)，在植物志中没有记载，其他文献也未见报道。

内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)，在被子植物较低的分类阶元上具有核苷酸序列的高度变异性和长度保守性，它能提供详尽的、系统学分析所需的可遗传性状，在许多被子植物的科内、属内和属间关系的系统发育研究中已被证明是十分有用的分子标记[3-4]。ITS分子标记也已广泛应用于竹类植物[5-8]。ITS序列短(600～700 bp)、两端连接高度保守区，而且具有拷贝数多、长度保守、一致进化、进化速率较快等优点，适用于被子植物近缘属间及种间甚至居群间关系的系统学研究[3，9]。本文利用ITS分子标记对部分茶竿竹亚属进行亲缘关系分析，从分子水平探讨怀集县铁厘茶竿竹和白水茶竿竹的分类地位。

1　材料与方法

1.1材料

材料收集包括茶竿竹5个变种，包括正种茶竿竹、福建茶竿竹(var.convexa)、薄箨茶竿竹(var.tenuis)、铁厘茶竿竹(var.ferrea)和白水茶竿竹(var.peshuiensis)；还采集了茶竿竹亚属的其他4个种，包括斑箨茶竿竹(P.notate)、笔竿竹(P.guangxianensis)、近实心茶竿竹(P.subsolida)和尖箨茶竿竹(P.acutivagina)(表1)。其中福建茶竿竹、薄箨茶竿竹、笔竿竹、近实心茶竿竹、斑箨茶竿竹和尖箨茶竿竹采自福建华安竹种园；正种茶竿竹、铁厘茶竿竹和白水茶竿竹采自广东省肇庆市怀集县。采集的样品均通过福建省华安县林业局华安竹种园邹跃国高级工程师的形态学鉴定。采集竹子嫩叶的混合样，经变性硅胶快速干燥后带回实验室置于-70 ℃冰箱保存备用。

表1材料名称及编号

Table 1The number and name of the samples

编号种名采样点1铁厘茶竿竹P.amabilisvar.ferrea广东怀集2福建茶竿竹P.amabilisvar.convexa福建华安3近实心茶竿竹P.subsolida福建华安4薄箨茶竿竹P.amabilisvar.tenuis福建华安5斑箨茶竿竹P.notate福建华安6尖箨茶竿竹P.acutivagina福建华安7正种茶竿竹P.amabilis广东怀集8笔竿竹P.guangxianensis福建华安9白水茶竿竹P.amabilisvar.peshuiensis广东怀集

1.2方法

1.2.1基因组DNA的提取

采用改良的CTAB法提取9个竹种的基因组DNA[10]，用Titertek-Berthold Colibri超微量分光光度计检测DNA的浓度和纯度，取1 μL在1%TAE琼脂糖凝胶上进行电泳检测DNA的质量，然后定量至100 ng·μL-1，-20 ℃保存备用。

1.2.2ITS序列扩增与测序

根据文献[11]由上海生工合成引物ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，对ITS1-5.8S rDNA-ITS2区域进行扩增。20 μL反应体系含50～100 ng基因组DNA，0.2 μmol·L-1ITS5，0.2 μmol·L-1ITS4，2 UExTaq聚合酶，1×PCR缓冲液 (10 mmol·L-1Tris-HCl， pH 8.3; 50 mmol·L-1KCl)，1.5 mmol·L-1MgCl2，0.2 mmol·L-1dNTP。反应条件如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 60 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 5 min；4 ℃保温[12]。PCR产物经回收、连接(载体为pMD18-T Vector)、大肠杆菌转化(菌株为DH5α)和菌液PCR检测后，将阳性克隆的菌液送上海生工进行测序，同时也进行PCR产物直接测序，克隆测序与PCR产物直接测序结果相同的ITS序列用于研究[13]。

1.2.3数据处理

将测序获得的序列与GenBank核酸序列数据库中的序列用blastn程序进行相似性比对，利用Vector NTI 11.5.1软件选取Clustal W方法进行多重序列比对，比对结果利用MEGA 6.0软件的非加权组平均法(UPGMA)构建进化树。通过DnaSP version 5.10软件(http://www.ub.es/dnasp/)[12，14]分析核苷酸多样性。

2　结果与分析

2.1ITS序列PCR扩增结果

从9个茶竿竹亚属竹种基因组DNA中均扩增出一条约600 bp的片段，图1所示为其中7个竹种的扩增结果。

M： GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder； 1～4， 6～8： 见表1； CK： 以水为对照。图1　引物ITS5和ITS4对茶竿竹亚属竹种的ITS序列扩增结果Fig.1　The amplification result of Chagan-bamboo species by ITS5 and ITS4

2.2PCR产物克隆

获得的片段转化至大肠杆菌后，以白色菌落培养的菌液为模板，用测序引物进行PCR检测，取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测[12]，如图2。

2.3测序结果及序列分析

测序获得的序列用blastn程序进行相似性比对确定为ITS区序列。以9个茶竿竹亚属竹种为研究对象，粳稻(Oryzasativassp.japonica)日本晴作为外类群进行同源性分析(图3)。由表2可知，9个竹种及水稻ITS序列之间的相似性均高于60%，其中福建茶竿竹和薄箨茶竿竹之间达99%。

M： GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder； 1～9： 见表1； CK： 以水为对照。图2　菌液PCR鉴定结果Fig.2　The result after idenfication of the bacteria liquid

表2九个茶竿竹亚属竹种ITS序列同源性分析

Table 2Homologous analysis of ITS from 9 Chagan-bamboo species

192478365Os193868684867677726998484838275747263299948978767267494907876726778776737268877777166370686166862560Os

注：表中数值为ITS序列通过CLUSTAL W多重序列比对后计算所得相似性；1～9：见表1；Os：水稻。

9个茶竿竹亚属竹种ITS序列长度差异较大，为559～648 bp，(G+C)含量变化范围为46.02%～57.65%。而与外类群日本晴相比，无论是序列长度还是(G+C)含量都存在较大的差异(表3)。

9个茶竿竹亚属竹种ITS序列中共有118个单一信息位点(singleton variable sites)，其中二变异体信息位点80个，三变异体信息位点33个，四变异体信息位点5个；142个简约信息位点(parsimony informative sites)，其中二变异体信息位点62个，三变异体信息位点60个，四变异体信息位点20个。插入/缺失位点(InDel)141个(表4)。

表3ITS序列(G+C)含量和长度多态性分析

Table 3(G+C) contents and length polymorphism of ITS

植物材料长度/bp(G+C)含量/%155955.64256555.58364850.93456755.56559146.02663653.62757155.17856555.22961457.65Os79948.56

注：1～9：见表1；Os：水稻。

红色方框表示引物ITS5和ITS4所在的位置； 1～9： 见表1； Os： 水稻。图3　九个茶竿竹亚属竹种ITS序列同源性分析Fig.3　Homologous analysis of ITS from 9 Chagan-bamboo species

表4ITS序列多态性位点分析

Table 4Polymorphism and InDel sites of ITS

多态区域变异类型位点数量单一信息位点二变异体信息位点80三变异体信息位点33四变异体信息位点5简约信息位点二变异体信息位点62三变异体信息位点60四变异体信息位点20插入/缺失位点141

2.4ITS序列系统演化分析

利用MEGA 6.0软件的非加权组平均法(UPGMA)对9个茶竿竹亚属竹种ITS序列构建进化树(图4)。结果显示，正种茶竿竹及其变种聚为一个大枝(图中黑框所示，自展值为100%)，其中怀集县的2个茶竿竹变种铁厘茶竿竹和白水茶竿竹聚在一起(自展值为100%)，而笔竿竹也在其中。茶竿竹亚属的其他3个种，包括斑箨茶竿竹、近实心茶竿竹和尖箨茶竿竹各成一枝。

3　讨论

从以上结果来看，聚类比较清晰，与经典的茶竿竹亚属分类(植物志)有其一致性。如笔竿竹在经典的分类中就与正种茶竿竹亲缘关系较近，在进化树中与正种茶竿竹聚在一起；怀集县的2个茶竿竹变种铁厘茶竿竹和白水茶竿竹以100%的支持率聚在一起，它们又与其他3个茶竿竹变种以100%的支持率聚在一起，从分子水平上佐证了它们是茶竿竹的2个变种，而且体现了一定的地理特异性。福建茶竿竹和薄箨茶竿竹之间ITS序列相似性达99%，在进化树中也以100%的支持率聚在一起，这与植物志中茶竿竹分变种两者的分类地位一致。其他3个竹种(尖箨茶竿竹、近实心茶竿竹和斑箨茶竿竹)在进化树中的位置也支持经典的茶竿竹亚属分类。

进化树是将PCR分离的9个茶竿竹亚属竹种的ITS序列通过多重序列比对以水稻ITS序列为外类群构建；显示的自展值是1 000。图4　茶竿竹亚属ITS序列UPGMA系统进化树Fig.4　The UPGMA tree of Chagan-bamboo species by using ITS sequences

竹类植物作为进化上的一个特殊类群，其茎(秆)高度木质化，营养生长周期长，且以营养繁殖为主，一旦开花，整片竹林死亡，导致繁殖器官很难获得，常用于分类的外部形态特征也会由于环境的变化而变化，使得竹子分类比较困难也比较混乱。本文采用的ITS分子标记从分子水平对茶竿竹亚属竹种进行鉴定，揭示其遗传物质内在的差异，没有时空限制。

ITS序列的进化较稳定、独立，序列分析也较少受主观影响；ITS序列中氨基酸或DNA碱基替换率能够为物种间的分支年龄和多样化率提供更有效的评估，从而保证更好的分离效率[13]。由于本身位点内(intralocus)和位点间(interlocus)进化的同步性，在许多物种内ITS不存在位点多态性，一般较少用于种以下水平的研究。但仍有不少报道发现ITS序列种内、亚种和居群间存在多态性[15]。大多数的被子植物种间ITS差异值为1.2%～10.2%，属间差异值为9.6%～28.8%[15-16]，而本文的研究结果表明，茶竿竹亚属内种间差异值较高，达到10%～32%，可见，ITS分子标记适用于茶竿竹亚属内系统发育的研究，当根据形态鉴别有困难时，可提供一种候选的，也是可靠的鉴别方法。

[1]耿伯介， 王正平. 中国植物志第九卷第一分册[M]. 北京: 科学出版社， 1996: 639-659.

[2]徐英宝， 许本立. 广东怀集茶秆竹生物学特性的初步研究[J]. 竹子研究汇刊， 1984， 3(2): 48-61.

[3]李林， 董敦义， 丁雨龙. 竹类分子系统学中的DNA标记[J]. 林业科技开发， 2009， 23(1): 10-15.

[4]张汉尧， 刘小珍， 龚秀会， 等. 竹子DNA提取方法改良及ITS-RFLP分析的初步研究[J]. 江西林业科技， 2006 (3): 3-5.

[5]HODKINSON T R， RENVOIZE S A， CHONGHAILE G N， et al. A comparison of ITS nuclear rDNA sequence data and AFLP markers for phylogenetic studies inPhyllostachys(Bambusoideae，Poaceae)[J].JournalofPlantResearch， 2000， 113(3): 259-269.

[6]GUO Z H， CHEN Y Y， LI D Z， et al. Genetic variation and evolution of the alpine bamboos (PoaceaeBambusoideae) using DNA sequence data[J].JournalofPlantResearch， 2001， 114(3): 315-322.

[7]诸葛强， 丁雨龙， 续晨， 等. 广义青篱竹属(Arundinaria)核糖体DNA ITS序列及亲缘关系研究[J]. 遗传学报， 2004， 31(4): 349-356.

[8]GUO Z H， LI D Z. Phylogenetics of theThamnocalamusgroup and its allies (Gramineae:Bambusoideae): inference from the sequences of GBSSI gene and ITS spacer[J].MolecularPhylogeneticsandEvolution， 2004， 30(1): 1-12.

[9]张峰. 用于植物分子系统学研究的基因片段[J]. 山东科学， 2004， 17(1): 55-58.

[10]DOYLE J J， DOYLE J L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J].Phytochemistry， 1987， 19(1): 11-15.

[11]WHITE T J， BRUNS T， LEE S， et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M]//INNIS M A， GELFAND D H， SNINSKY J J， et al. PCR protocols: A guide to methods and applications. New York: Academic Press. 1990: 315-322.

[12]钟浩.mariner-like转座子在竹亚科的分布、多态性、进化及转座特性的研究[D]. 杭州: 浙江农林大学， 2010.

[13]尹昭坤， 廖承红， 徐立新， 等. 基于ITS序列分析对海南普通野生稻籼粳分化的研究[J]. 生物技术进展， 2012， 2(4): 270-275.

[14]LIBRADO P， ROZAS J. DnaSP v5: A software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data[J].Bioinformatics， 2009， 25(11): 1451-1452.

[15]闫艳华， 金华， 侯和胜， 等. 抗逆速生吴屯杨与近缘种的ITS序列分析[J]. 贵州农业科学， 2011， 39(4): 180-183.

[16]屈良鹄， 陈月琴. 生物分子分类检索表——原理与方法[J]. 中山大学学报(自然科学版)， 1999， 38(1): 1-6.

(责任编辑张韵)

Analysis on genetic relationship of some Chagan-bamboo species by using ITS region sequence

ZHONG Hao1，2， GAO Gui-bin1，2， WU Liang-ru1，2，*

(1.ChinaNationalBambooResearchCenter，Hangzhou310012，China; 2.KeyLaboratoryofHighEfficientProcessingofBambooofZhejiangProvince，Hangzhou310012，China)

The molecular differences amongPseudosasaamabilisvar.ferrea，Pseudosasaamabilisvar.peshuiensisand other Chagan-bamboo species were identified by analyzing internal transcribed spacer sequence in nrDNA ofP.amabilisvar.ferrea，P.amabilisvar.peshuiensisand other 7 Chagan-bamboo species. and the phylogenetic tree was established to clarify their taxonomic status. The results showed that ITS length of all tested species ranged from 559 to 648 bp， and their (G+C) content ranged from 46.02% to 57.65%. ITS length ofP.amabilisvar.ferreaandP.amabilisvar.peshuiensiswas 559 bp and 614 bp, respectively. Their (G+C) content was 55.64% and 57.65%, respectively. The established phylogenetic tree showed thatP.amabilisand its varieties were clustered in one big group， in whichP.amabilisvar.ferreaandP.amabilisvar.peshuiensiswere clustered into one small group. The above results indicated thatP.amabilisvar.ferreaandP.amabilisvar.peshuiensiswere two variants ofPseudosasaamabilis.

Pseudosasaamabilis; ITS; phylogenetic tree

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.02.18

2015-06-01

中国林科院基本科研业务费专项资金(CAFYBB2014QA038)；国家林业局竹子研究开发中心研究基金项目(ZXJJ201207)；浙江省科技计划项目(2014F10047)

钟浩(1984—)，男，浙江杭州人，硕士，助理研究员，研究方向为竹子分子遗传。E-mail: 13706710845@163.com

，吴良如，E-mail: boteatree@163.com

Q78；S795.1

A

1004-1524(2016)02-0291-06

钟浩，高贵宾，吴良如.部分茶竿竹亚属竹种亲缘关系的ITS序列分析[J].浙江农业学报，2016，28(2)： 291-296.