树舌灵芝发酵产漆酶培养基优化

潘志恒，岳　鹍，孙勇民，刘　鹏

（天津现代职业技术学院，天津 300350）

树舌灵芝发酵产漆酶培养基优化

潘志恒，岳鹍*，孙勇民，刘鹏

（天津现代职业技术学院，天津 300350）

在单因素试验的基础上，采用Plackett-Burman设计对影响树舌灵芝产漆酶活性的因素进行了评价，筛选出具有显著影响的因素并优化了树舌灵芝产漆酶培养基的主要成分。结果表明，产酶培养基中小麦麸皮、豆粕、硫酸铜和香兰素的添加量对树舌灵芝产漆酶活性具有显著影响；预测得到最佳培养基组成为：小麦麸皮（20 g/L）、豆粕（2 g/L），硫酸铜（0.625 g/L）和香兰素（0.037 5 g/L）；优化培养基后漆酶活性达到45.85 IU/mL，约为优化前的56倍，为大规模发酵生产漆酶提供技术支持。

漆酶；树舌灵芝；Plackett-Burman设计；发酵

漆酶（Laccase，EC 1.10.3.2）是一种含有4个Cu2+的多酚氧化酶，学名对二酚-二氧氧化还原酶，属于氧化酶的蓝铜家族。这类酶最初发现于漆树的树脂中，由此得名漆酶。漆酶在自然界中广泛存在，在植物体及几乎所有的真菌中都发现了漆酶或其类似物［1］。不同漆酶的作用范围不尽相同，初步统计漆酶可催化的不同类型底物已达约250个。随着漆酶催化性能研究的不断深入，国内外漆酶应用范围也在不断扩大，涉及造纸、环保、食品、医药、纺织等各个领域［2］。

发酵培养真菌生产漆酶的周期普遍较长，一般需要20 d左右。目前国内液态发酵生产的漆酶菌株较少，而且稳定性差，漆酶发酵水平低，因此，漆酶主要依靠进口，严重限制了漆酶工业酶制剂的制备和应用。本研究在通过基因工程与传统诱变方法相结合改造获得树舌灵芝（Ganoderma applanatum）菌株的基础上，采用小麦麸皮、豆粕和余量水等组成发酵培养基，对漆酶液体发酵工艺中关键因子进行优化，为大规模发酵生产漆酶提供技术支持。

1　材料与方法

1.1材料与设备

1.1.1材料与试剂

树舌灵芝（Ganoderma applanatum），由天津现代职业技术学院生物工程学院选育并保藏。

葡萄糖、琼脂粉、酵母浸膏、硫酸镁、硫酸铵、磷酸一氢钠、磷酸二氢钾、氯化钠等，均为国产分析纯。

ABTS试剂盒，由碧云天生物技术研究所生产。

1.1.2仪器与设备

HCB-900V型超净工作台，HPX-9162MBE型恒温培养振荡器，GZX-9146MBE电热鼓风干燥箱，YXQ-LS50SII压力蒸汽灭菌器，FA2004N型电子天平，UV-1800PC-DS紫外可见分光光度计。

1.2方法

1.2.1培养基的制备

PDA培养基：土豆粉200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1 000mL。

液体发酵培养基：葡萄糖20 g，酵母浸膏2 g，蒸馏水1 000mL。

基础产酶培养基：葡萄糖10 g，硫酸镁0.5 g，硫酸铵2g，Na2HPO40.2g，KH2PO41g，蒸馏水1000mL。

培养基的灭菌条件为：120℃、30min。

1.2.2平面菌种培养

在无菌条件下，将树舌灵芝菌株接种到平面PDA培养基上，25℃避光培养8 d。

1.2.3液体发酵条件

250mL摇瓶中放入100mL液体发酵培养基，在无菌条件下接入“1.2.2”中直径1 cm左右的菌丝体4块，置于25℃恒温培养振荡器、150 r/min避光培养10 d，抽滤分离发酵液，取滤液测定酶活性，将滤纸于70℃下烘干至恒重，称重，减去滤纸质量，得到菌体的干重（以g/L表示），即得到树舌灵芝菌种的生物生长量。

1.2.4产酶培养

250mL三角瓶中接种树舌灵芝菌株，接种量为15%，在25℃、150 r/min的条件下摇瓶培养10 d。

1.2.5漆酶活性的测定

以ABTS为底物，采用分光光度计测定［3-4］。3mL酶活反应体系中包括1mL漆酶滤液3倍稀释液、0.2mL 3mmol/L的ABTS和1.8mL 0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH=4.5），25℃水浴保温反应5min，于420 nm处测定吸光度。对照液为已灭活的酶液。1个漆酶单位（IU）为1min转化1μmolABTS的所需酶量。

1.2.6产酶培养基的优化

1.2.6.1单因素试验

（1）碳源对漆酶活性的影响

分别以不同的碳源（小麦麸皮、玉米粉、蔗糖、麦芽糖、淀粉，均为20 g/L）代替基础产酶培养基中的葡萄糖进行考察。

（2）氮源对漆酶活性的影响

碳源采用小麦麸皮，分别以不同氮源（豆粕、蛋白胨、硝酸铵、磷酸二氢铵，均为2 g/L）代替基础产酶培养基中的硫酸铵，考察影响酶活性的不同氮源。

（3）金属离子对漆酶活性的影响

碳源和氮源分别采用小麦麸皮和豆粕，分别用不同的金属离子（硫酸锌、碳酸钙、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸铜，均为0.5 g/L）代替基础产酶培养基中的硫酸镁，考察影响酶活性的不同金属离子。

（4）诱导剂对漆酶活性的影响

碳源、氮源和金属离子分别采用小麦麸皮、豆粕和硫酸铜，分别添加不同诱导剂（没食子酸、香兰素、阿魏酸、邻甲苯胺，均为0.03 g/L），以未加诱导剂的处理作为对照，筛选出最佳的产酶诱导剂。

按“1.2.4”中的方法培养7 d，平行试验3次，以漆酶活性为响应值，结果取平均值。

1.2.6.2Plackett-Burman试验

在单因素试验结果的基础上，选择影响漆酶活性的6个因素进行考察，每个因素取高（1）、低（-1）两个水平，按试验方法“1.2.4”进行培养，以漆酶活性为响应值，试验重复3次，结果取平均值，选用N=12的Plackett-Burman设计，为考察试验误差设3个虚拟变量，试验设计如表1所示。

表1　Plackett-Burman试验设计因素水平表Table 1　Factors and levels of Plackett-Burman design

1.2.7数据处理

采用MINITAB 16.0分析软件进行处理。

2　结果与分析

2.1基础产酶培养基中漆酶的活性和树舌灵芝的生物生长量

由图1可见，在10 d的培养过程中，前7天树舌灵芝所产漆酶活性呈逐渐升高的趋势，第7天达到最高，为0.82 IU/mL，之后漆酶活性下降。培养前期，树舌灵芝的生物生长量保持增加，在第7天达到最大值，菌体的干重为0.18 g/L；培养8～10 d，树舌灵芝的生物生长量呈下降趋势。由此可见，在基础培养基中培养树舌灵芝产漆酶，树舌灵芝的生物生长量及漆酶的活性都很低。

2.2单因素试验结果

2.2.1碳源对漆酶活性的影响

由图2可见，在不同碳源的产酶培养基中，漆酶活性大小的顺序为：小麦麸皮＞玉米粉＞淀粉＞麦芽糖＞蔗糖，即以小麦麸皮为碳源时，漆酶的活性最高，而以蔗糖和麦芽糖为碳源时，漆酶活性较低，其原因可能是因为简单碳源在发酵过程中消耗较快，碳源浓度难以维持高水平。

2.2.2氮源对漆酶活性的影响

由图3可见，豆粕是最佳的氮源，能明显提高漆酶活性，对碳源和氮源优化后，漆酶活性较优化前提高了约13倍。其次为蛋白胨，相比而言，硫酸铵、硝酸铵、磷酸二氢铵等小分子无机氮源利用率比较差。这可能是由于不同菌种对氮源喜好不同，相关研究也表明，侧耳Pleurotus ostreatus很难利用酵母抽提物（YE）作为氮源［6］，真菌Panus tigrinus对酒石酸铵利用效率很高［7］，真菌Cerrena unicolor产漆酶的培养基则使用玉米浆［8］。

2.2.3金属离子对漆酶活性的影响

由图4可见，Cu2+可明显提高树舌灵芝所产漆酶的活性，Ca2+、Mg2+和Fe2+的诱导作用次之，而Zn2+对树舌灵芝所产漆酶有明显的抑制作用。漆酶是一种含Cu2+的蓝色多酚氧化酶，其活性与Cu2+有着密切的关系，欧阳翔等［9］研究表明，Cu2+能够促进漆酶基因的高效表达。

2.2.4诱导剂对漆酶活性的影响

对漆酶进行诱导是提高漆酶产量常用的方法，芳香族化合物邻甲苯胺、香兰素、没食子酸和阿魏酸常被用作漆酶的诱导剂［10-11］。由图5可见，这些诱导剂均能不同程度地提高树舌灵芝产漆酶的活性，其中香兰素诱导的效果最好，漆酶活性最高，其次分别为没食子酸、邻甲苯胺和阿魏酸。

2.3Plackett-Burman试验设计处理及响应值

试验设计及漆酶活性的响应值见表2。

表2　Plackett-Burman设计方案及响应值Table 2　Design and result of Plackett-Burman test

2.4漆酶活性主要影响因子的筛选

采用MINITAB 16.0分析软件对Plackett-Burman试验结果进行分析，拟合得到的模型方程为：

Y=39.457+0.190X1-0.602X2-0.443X3-1.995X4-1.868X5-0.095X6+1.203X7+1.298X8-0.412 X9

由表3可知，调整后回归方程的误差系数R2adj为0.956 6，说明试验中95.66%的数据可由此模型解释，F检验（P=0.035）说明回归方程具有显著的统计学意义。

表3　回归模型的方差分析Table 3　Variance analysis of regressionmodel

由表4偏回归系数及显著性检验可知，影响树舌灵芝产漆酶活性的主要影响因子为：X4小麦麸皮（P=0.029）、X5豆粕（P=0.025）、X7硫酸铜（P=0.034）和X8香兰素（P=0.029）（95%置信区间）。

表4　偏回归系数及显著性检验Table 4　Partial regression coefficients and their significance

2.5树舌灵芝产漆酶培养基最佳配方的确定

通过回归模型预测树舌灵芝产漆酶培养基的最佳配方为：小麦麸皮（20 g/L）、豆粕（2 g/L）、硫酸铜（0.625 g/L）、香兰素（0.037 5 g/L），该条件下，漆酶活性理论上可达46.61 IU/mL。由图6可见，实际操作中，通过优化培养基的培养，到第7天，漆酶活性达到最高，为45.85 IU/mL，为优化前的约56倍；同时，第7天时生物生长量达到最高，为3.12g/L，约为优化前的17倍。

3　结论

本研究在单因素试验的基础上，采用Plackett-Burman试验设计对影响树舌灵芝产漆酶活性的因素进行了评价，优化了树舌灵芝产漆酶培养基的主要成分。结果表明，产酶培养基中小麦麸皮、豆粕、硫酸铜和香兰素的添加量对树舌灵芝产漆酶活性具有显著影响（P＜0.05）；通过回归方程预测得到最佳培养基组成为：小麦麸皮（20 g/L）、豆粕（2 g/L）、硫酸铜（0.625 g/L）和香兰素（0.037 5 g/L）；优化培养基后，漆酶活性达到45.85 IU/mL，比优化前有大幅提高。

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Optim ization of CultureM edium for Laccase Production from Ganoderma applanatum

PAN Zhi-heng，YUE Kun*，SUN Yong-min，LIU Peng
（Tianjin Modern Vocational Technology College，Tianjin 300350，China）

On the basis of single factor experiment，the Plackett-Burman experimental design was applied to evaluate the factors that potentially influence the laccase activity of Ganoderma applanatum.The most important factors were selected to optimize the culture medium.Results showed that，different levels of wheat bran，soybean meal，copper sulphate and vanillin could significantly influence the laccase activity.The most optimized culture medium included wheat bran（20 g/L），soybean meal（2 g/L），copper sulphate（0.625 g/L）and vanillin（0.037 5 g/L）. Laccase activity increased up to 45.85 IU/mL，which was approximate 56 times before the optimization.This study provided the technical support for large scale fermentation of laccase.

laccase；Ganoderma applanatum；Plackett-Burman design；fermentation

Q939.97

A

10.3969/j.issn.1009－6221.2016.04.019

天津市技术开发工作扶持经费项目（ysk2011-29）

潘志恒（1984—），男，汉族，硕士，讲师，主要从事生物发酵、检测分析等方面的研究工作。

岳鹍，硕士，副教授，主要从事食品发酵等方面的研究工作。

2016-03-21