响应面法优化酶-超声波辅助同步提取鸭骨素工艺

刘佳慧，王修俊，*，尹　爽，田　多，王纪辉

（1.贵州大学发酵工程与生物制药省级重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025）

响应面法优化酶-超声波辅助同步提取鸭骨素工艺

刘佳慧1，2，王修俊1，2，*，尹爽1，2，田多1，2，王纪辉1，2

（1.贵州大学发酵工程与生物制药省级重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025）

以新鲜鸭骨为原料，采用酶-超声波辅助同步提取鸭骨素，并以可溶性固形物和蛋白质含量为考察指标，在单因素试验的基础上采用响应面法优化鸭骨素提取工艺条件。结果表明，酶-超声波辅助同步提取鸭骨素的最佳工艺条件为：超声温度62℃，超声功率248W，超声时间5.1 h，酶添加量

1.34%。此条件下鸭骨素提取液中可溶性固形物含量和蛋白质含量分别为（25.8±0.047）°Bx和（20.9± 0.018）g·100 g-1。采用酶-超声波辅助同步提取的鸭骨素提取液中可溶性固形物和蛋白质含量极显著高于单一酶解法、微波提取法和超声波提取法（P＜0.01）。

鸭骨素；提取工艺；酶解；超声波；响应面法

我国是畜禽肉类消费量最大的国家之一，而动物骨骼约占动物体重的20%～30%，因此我国畜禽骨资源极为丰富［1-3］。三穗麻鸭是我国四大名鸭之一，贵州省三穗县大力发展鸭产业，现已成为贵州省的特色优势产业，但每年都有大量的鸭骨未得到充分利用，只是部分加工成骨油、饲用骨粉、肥料等附加值很低的传统产品［4-6］，造成资源浪费和环境污染。鸭骨素中含有丰富的营养物质，但是精深加工开发与利用方面较差，导致精细加工产品及功能性产品较少。

畜禽骨骨素是新鲜畜禽骨经酸法、碱法和酶法制得的初级骨提取物，具有一定的增香效果。骨素产品作为一种天然的营养食品，富含蛋白质、多肽、氨基酸及其他无机盐，这些物质都是易于被人体吸收和必需的营养物质。根据骨素的这些特性可以将其添加到营养口服液、速溶氨基酸冲剂等保健品当中，从而达到促进新陈代谢和伤口愈合的效果。因此，可以用该类物质来研制满足不同人群需求的保健食品。

酶解法是一种新的动物蛋白水解液的生产方法，与现有的化学法和物理法相比，具有定向、易控、温和等优点［7-10］。近年来，声学技术同生物、食品技术领域不断交叉、渗透，应用超声技术在水溶液中提高酶活力、促进酶催化反应已有研究报道［11-12］。超声波不但能加速酶解速度，而且能改善产品品质，优化反应条件［13-14］；同时在食品加工技术中，超声可以辅助或强化提取。本试验采用酶-超声波辅助同步提取法对鸭骨中鸭骨素的提取效果进行研究，通过Box-Behnken试验设计和响应面分析，获得提取效果最佳的工艺参数条件，为鸭骨副产品深加工的开发与利用提供参考依据。

1　材料与方法

1.1材料与设备

1.1.1材料与试剂

新鲜鸭骨，由贵州三穗翼宇鸭业有限公司提供，预处理后于-18℃冰箱中保存，备用。

木瓜蛋白酶（800U/mg）、碱性蛋白酶（800U/mg）、中性蛋白酶（800 U/mg）、胰蛋白酶（800 U/mg），均由上海源叶生物有限公司生产；硫酸铜、硫酸钾、硫酸、硼酸、氢氧化钠等，均为国产分析纯。

1.1.2仪器与设备

FA2004B电子天平，DZKW-4电子恒温水浴锅，GZX-GF101-3-BS-Ⅱ电子恒温鼓风干燥箱，RE-52A旋转蒸发器，GL-20G高速冷冻离心机，SIN82T手持式折光仪，HC-300T2高速多功能粉碎机，KQ-300DE型数控超声波清洗器。

1.2方法

1.2.1鸭骨素提取工艺流程

鸭骨→解冻→粉碎→超声酶解→灭酶→过滤→离心→浓缩→鸭骨素提取液

1.2.2操作要点

1.2.2.1原料选择

挑选较大的鸭腿骨、胸骨和翅骨，尽量剔除鸭肉。

1.2.2.2粉碎

将鸭骨于粉碎机内粉碎5min，成鸭骨泥。

1.2.2.3灭酶

将粉碎后的鸭骨置于95℃水浴锅中灭酶15min。

1.2.2.4过滤、离心

酶解液过滤后以4 000 r/min离心10min。

1.2.2.5浓缩

取离心后上层酶解液，置于旋转蒸发仪上80℃浓缩10min，至接收烧瓶中液体无明显增加。

1.2.3试验方案设计

1.2.3.1单因素试验

准确称取鸭骨粉100 g，液料比120mL/100 g（由于液料比较小情况下获得酶解产物较少，不利于后续试验，所以选择液料比120 mL/100 g），超声温度60℃，超声时间3 h，超声功率210W，加酶量1.0%的条件下，考察木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶对鸭骨素提取液中可溶性固形物含量的影响，进行酶种类的筛选。

准确称取鸭骨粉100 g，在液料比120mL/100 g木瓜蛋白酶添加量1.0%，超声温度60℃，功率210W，时间3 h的条件下，以鸭骨素提取液中可溶性固形物和蛋白质含量为指标，分别考察超声温度、超声功率、超声时间、加酶量、液料比对酶解提取效果的影响，初步确定因素与水平，单因素试验设计见表1。

表1　单因素试验设计Table 1　Single factor experiment design

1.2.3.2响应面试验设计

在单因素试验的基础上，以总可溶性固形物含量（°Bx）和蛋白质含量为响应值，根据Box-Behnken试验设计原理，以超声温度、超声功率、超声时间、加酶量为主要影响因素。进行四因素三水平组合试验，因素与水平见表2。

表2　Box-Behnken试验设计因素水平编码表Table2　ExperimentalvariablesandlevelsforBox-Behnken design

1.2.3.3不同提取方式的比较

酶解法提取条件：准确称取鸭骨100g，加入木瓜蛋白酶1.0%，液料比120mL/100g，水浴温度60℃条件下酶解3h，测定鸭骨素提取液中可溶性固形物和蛋白质含量。

超声法提取条件：准确称取鸭骨100g，液料比120mL/100g，超声温度60℃，超声时间3h，测定鸭骨素提取液中可溶性固形物和蛋白质含量。

微波法提取条件：准确称取鸭骨100g，液料比120mL/100g，微波功率300W，提取时间1h，测定鸭骨素提取液中可溶性固形物和蛋白质含量。

1.2.4测定项目与方法

1.2.4.1可溶性固形物含量（SSC）

使用手持折光仪测量，用百利度（°Bx）来反映可溶性固形物的含量。

1.2.4.2蛋白质含量采用凯氏定氮法［15］测定。计算公式为：

式中：X为试样中蛋白质的含量（g/100g）；V1为试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积（mL）；V2为空白试剂消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积（mL）；V3为吸取消化液的体积（mL）；c为硫酸或盐酸标准滴定液浓度（mol/L）；0.0140为1.0mL硫酸［C（1/2H2SO4）=1.000mol/L］或盐酸［C（HCl）=1.000mol/L］标准滴定溶液相当的氮的质量（g）；m为试样的质量（g）；F为氮换算为蛋白质的系数。

1.2.5数据处理

采用Excel2003软件进行数据处理，采用Design-Expert8.0.6软件对响应面试验进行分析，采用SPSS17.0软件进行差异显著性分析。

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1酶种类的选择

研究表明［16］酶解液中可溶性固形物含量与蛋白质含量呈线性关系，为节约选酶试验的时间，暂以可溶性固形物含量为考察指标。由图1可知，采用不同种类的酶对鸭骨进行酶解，酶解液中可溶性固形物含量较对照有不同程度的增加。其中，以木瓜蛋白酶水解后鸭骨素提取液中可溶性固形物含量最高。因此，选用木瓜蛋白酶对鸭骨素进行提取。

2.1.2超声温度对鸭骨素提取液中可溶性固形物和蛋白质含量的影响

由图2可知，随着超声温度的升高，鸭骨素提取液中可溶性固形物和蛋白质含量均呈先升高后降低的趋势。进行酶解反应时，随着温度升高，酶解反应加快，当超声温度为60℃时，鸭骨素提取液中可溶性固形物和蛋白质含量最高，但继续升高超声温度，蛋白酶变性失活，不利于酶解反应。在温度的作用下，鸭骨中可溶性固形物和蛋白质也在不断溶出，因此，在酶和超声温度的双重作用下，确定适宜的超声温度为60℃。

2.1.3超声功率对鸭骨素提取液中可溶性固形物和蛋白质含量的影响

由图3可知，随着超声功率的提高，鸭骨素提取液中可溶性固形物与蛋白质含量均呈先下降后上升再下降的变化趋势。超声功率较低时，随超声功率升高，酶的活性逐渐上升，促进鸭骨素的析出，超声功率为240W时两指标均达到最高值，而当超声功率继续提高时酶活性则下降［17-20］。适宜功率的超声波在一定程度上促进酶的催化作用，影响程度因酶的种类而不同，试验中要根据不同的酶选择最佳的超声功率，本试验确定适宜的超声功率为240W。

2.1.4超声时间对鸭骨素提取液中可溶性固形物和蛋白质含量的影响

由图4可知，随超声时间延长，鸭骨素提取液中可溶性固形物和蛋白质含量均不断升高，当超声5 h时，鸭骨素中可溶性固形物和蛋白质含量达到最高，之后其含量均呈下降趋势，这可能是由于超声5 h时酶促反应充分，继续增加超声时间不再促进酶的水解。因此，确定适宜的超声时间为5 h。

2.1.5加酶量对鸭骨素提取液中可溶性固形物和蛋白质含量的影响

由图5可知，当加酶量过少时，酶解速度较慢或酶解反应不完全，随着加酶量的增加，鸭骨素提取液中可溶性固形物和蛋白质含量均不断升高。当酶添加量为1.3%时，可溶性固形物和蛋白质含量达到最高值，此时鸭骨被酶完全水解，继续增加酶的用量则可溶性固形物和蛋白质含量不再升高。因此，确定适宜的加酶量为1.3%。

2.1.6液料比对鸭骨素提取液中可溶性固形物和蛋白质含量的影响

由图6可知，当液料比为60mL/100 g时，鸭骨素提取液中可溶性固形物和蛋白质含量达最高，之后继续增加溶剂用量，可溶性固形物和蛋白质含量持续下降，这是因为溶剂的增加使反应体系内酶的浓度变小，导致酶与底物反应不彻底，从而使可溶性固形物和蛋白质含量下降。因此，确定适宜液料比为60mL/100 g。

2.2响应面优化试验结果

2.2.1回归模型的建立及方差分析

为确定鸭骨素的最佳提取工艺，参考单因素试验结果，通过Box-Behnken进行响应面试验，试验设计与结果见表3。

表3　Box-Behnken试验设计与结果Table3　DesignandresultsofBox-Behnkentest

利用Design-Expert8.0.6软件对表3中的数据进行多元回归分析，得到SSC（Y1）、蛋白质含量（Y2）对自变量A、B、C、D（其中变量以得到的-1到1区间的最佳条件代入）的二次多项回归方程为：

Y1=25.64+1.13A+0.82B+0.90C+0.68D-0.20AB-0.13AC+0.55AD-0.47BC-0.32BD-0.100CD-3.67A2-2.58B2-2.66C2-2.69D2

Y2=20.58+0.98A+1.51B+0.17C+0.57D-0.097AB-0.085AC-0.22AD-0.44BC-0.22BD-0.062CD-2.75A2-1.41B2-2.30C2-1.94D2

以可溶性固形物和蛋白质含量为响应值的响应面方差分析结果分别见表4、5。

由表4可知，响应面模型P＜0.0001，表明回归模型的回归效果极显著；失拟项P=0.3054＞0.05，即模型失拟项不显著，表明响应面模型符合，即试验数据可靠。本模型的R2=0.9741，表明响应面模型与试验数据拟合良好［21］。响应面模型的显著性分析结果表明：A、B、C、D、A2、B2、C2、D2对鸭骨素提取液中可溶性固形物含量影响极显著（P＜0.01），AD、BC对鸭骨素提取液中可溶性固形物含量影响显著（P＜0.05）。各试验因素对提取液中可溶性固形物含量的影响依次是A（超声温度）＞C（超声时间）＞B（超声功率）＞D（加酶量）。

由表5可知，响应面模型P＜0.0001，表明回归模型的回归效果极显著；失拟项P=0.1733＞0.05，即模型失拟项不显著，表明响应面模型符合，即试验数据可靠。本模型的R2=0.9589，表明响应面模型与试验数据拟合良好。响应面模型的显著性分析结果表明：A、B、D、A2、B2、C2、D2对鸭骨提取液中蛋白质含量影响极显著（P＜0.01），各试验因素对鸭骨素提取液中蛋白质含量的影响依次是B（超声功率）＞A（超声温度）＞D（加酶量）＞C（超声时间）。

表4　可溶性固形物含量为响应值的回归模型方差分析结果Table4　Thevarianceanalysisresultsoftheregressionmodel withthesolublesolidcontentastheresponsevalue

表5　蛋白质含量为响应值的回归模型方差分析结果Table 5　The results of variance analysis of the regressionmodel with protein content as the response value

2.2.2响应面交互作用分析

2.2.2.1可溶性固形物含量

由Design-Expert8.0.6软件绘制以可溶性固形物含量为响应值的各因子交互作用的响应面图，见图7。

由图7A、B可知，超声温度和超声功率、超声温度和超声时间的交互作用对鸭骨素提取液中可溶性固形物含量的影响不明显；由图7C、D可知，随着超声温度的升高和加酶量的增加，以及超声功率的增加和超声时间的延长，鸭骨素提取液中可溶性固形物含量呈先增后降的变化趋势，超声温度和加酶量、超声功率和超声时间的交互作用对鸭骨素中可溶性固形物含量的影响达显著水平；由图7E可知，随着超声功率和加酶量的增加，可溶性固形物含量先升高后下降；由图7F可知，随着超声时间的延长和酶的增加，鸭骨素提取液中可溶性固形物含量先上升后降低，当超声时间为5 h、酶添加量达到1.3%时，可溶性固形物含量达到最高点。

2.2.2.2蛋白质含量

由Design-Expert 8.0.6软件绘制以蛋白质含量为响应值的各因子交互作用的响应面图，见图8。

图8A反映出随着超声温度的升高和超声功率的增大，鸭骨素提取液中蛋白质含量明显增高，方差分析结果表明，超声温度和超声功率交互作用对蛋白质含量的影响达到极显著水平；由图8B可知，随着超声温度的升高和超声时间的延长，蛋白质含量先升高后降低；由图8C、D可知，随着超声温度的升高和加酶量的增加及超声功率和时间的增加，蛋白质含量增加不显著；由图8E可知，随着超声功率和加酶量的增加，蛋白质含量先升高后下降；由图8F可知，随着超声时间的延长和加酶量的增加，蛋白质含量达到最高点后下降，在超声时间5 h，加酶量1.3%时，蛋白质含量最高。

2.2.3响应面分析优化结论验证

对二次多元回归模型进行分析并求解，得出鸭骨素提取最佳工艺参数为：超声温度61.59℃，超声功率248.57W，超声时间5.07 h，加酶量1.34%，此条件下可溶性固形物和蛋白质含量分别可达到25.82°Bx、20.99 g·100 g-1。为证实响应面法优化所得结论的准确性，将最佳工艺修正为超声温度62℃、超声功率248W、超声时间5.1 h、加酶量1.34%，此条件下进行3次平行试验，测得可溶性固形物和蛋白质含量平均值分别为（25.8±0.047）°Bx、（20.9±0.018）g·100 g-1。该值落在响应值的95%置信区间内，说明响应面优化得到的工艺参数可靠。

2.3不同提取方式的比较

由表6可知，酶-超声波辅助同步提取法与单一酶解法比较，鸭骨提取液中蛋白质含量提高了约

26.6%，可溶性固形物含量提高了约23.4%，且远高于单一微波提取法和单一超声波提取法。因此，酶-超声波辅助同步提取法是提取鸭骨素的最佳方法。

表6　不同提取方式的比较Table 6　Comparison of different extractionmethods

3　结论

在单因素试验的基础上，通过响应面分析法，得到酶-超声波辅助法同步提取鸭骨中鸭骨素的最佳工艺参数为：超声温度62℃，超声功率248W，超声时间5.1 h，加酶量1.34%。此条件下，鸭骨素提取液中可溶性固形物含量为（25.8±0.047）°Bx，蛋白质含量为（20.9±0.018）g·100 g-1，较单一酶解提取法、微波法和超声波法鸭骨提取液中蛋白质含量和可溶性固形物含量都有不同程度的提高。

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Optim ization of Enzymatic-Ultrasonic Assisted Extraction of Duck Bone Extract by Response SurfaceM ethodology

LIU Jia-hui1，2，WANG Xiu-jun1，2，*，YIN Shuang1，2，TIAN Duo1，2，WANG Ji-hui1，2

（1.Guizhou Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy，Guizhou University，Guiyang550025，China；2.Collegeof LiquorMaking&Food Engineering，Guizhou University，Guiyang550025，China）

The fresh duck bone was taken as raw material，the duck bone extractwas obtained by enzymatic-ultrasonic assisted extraction with the contents of soluble solid and protein as indexes.On the basis of single factor experiment，response surface method was used to optimize the extraction process of duck bone.The results showed that，the optimum technological conditions for the simultaneous extraction of duck bone by enzymatic-ultrasonic assisted extraction were:ultrasonic temperature 62℃，ultrasonic power 248W，ultrasonic time 5.1 h，enzyme addition amount of 1.34%.Under these conditions，the total soluble solid content could reach（25.8±0.047）°Bx and the protein content could reach（20.9±0.018）g·100 g-1.The contents of soluble solid and protein in duck bone extractwith enzymatic-ultrasonic assisted extractionmethod were extremely significant higher than that of single enzyme hydrolysis，microwave or ultrasonic extractionmethod（P＜0.01）.

duck bone extract；extraction process；enzymatic hydrolysis；ultrasonic；response surfacemethod

TS251.94

A

10.3969/j.issn.1009－6221.2016.04.018

贵州省科技成果转化引导基金计划（黔科合成转字［2014］5093号）

刘佳慧（1992—），女，汉族，在读硕士，研究方向：农产品加工及贮藏工程。

王修俊，学士，教授，硕士生导师，研究方向：食品保鲜贮藏与加工，食品质量安全与品质控制。

2016-04-11