高效液相色谱法测定马铃薯中GA3含量

雷　静，许立兴，崔新仪，关文强，*，李　宁，王艳斌

（1.天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津300134；2.天津农学院园艺系，天津300384）

高效液相色谱法测定马铃薯中GA3含量

雷静1，许立兴1，崔新仪2，关文强1，*，李宁2，王艳斌1

（1.天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津300134；2.天津农学院园艺系，天津300384）

建立了高效液相色谱法测定马铃薯中赤霉素（GA3）含量的方法。采用反相C18色谱柱，以甲醇∶水=3∶7（V∶V）为流动相，流速1.0 mL/min，进样量20μL，检测波长为235 nm。GA3的平均回收率为99.13%，方法检出限为0.09mg/kg，定量限为0.12mg/kg。该方法操作简单，可快速、准确地分离和测定马铃薯中的GA3含量。

高效液相色谱法；赤霉素；马铃薯；检测

马铃薯块茎在萌芽前需经历一段时间的休眠期。在马铃薯的休眠期内，即使块茎处于一个适宜发芽的条件下也不会发芽［1］。马铃薯块茎休眠期的长短受诸多因素的影响，其中内源激素含量对块茎的休眠与萌发起着主导性的作用［2-6］。赤霉素为一大类植物激素，其中使用最广和研究最多的是GA3，其对于打破马铃薯休眠，促进马铃薯块茎萌发具有重要作用［7］。植物内源赤霉素在马铃薯中含量甚微，激素类似物干扰组分多，且其对温度等条件极为敏感，因而准确测定其含量比较困难。

植物内源赤霉素的主要测定方法有免疫分析法、气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）和色谱-质谱联用法。其中免疫分析法主要是酶联免疫法（ELISA）和放射免疫法（RIA）。ELISA法选择性高、灵敏度强，并且操作简便，但对于植物激素进行定量分析时，测定结果的准确性和重现性差，因此并未得到广泛使用。RIA法灵敏度高，能够达到nmol或pmol的检测水平，但测定时需125I和3H等放射性同位素。由于放射性同位素的稳定性差，并且对操作者会造成身体损害，因此RIA法已较少使用。GC法需要被测物具有较低的极性和气化温度，但赤霉素的挥发性较差，需对其进行一系列复杂的衍生化处理后才能进行GC分析，繁琐的样品前处理增加了工作量，不利于大批量检测［8］。色谱-质谱联用法测定结果准确且重复率高，但样品净化过程较为复杂，测定成本相对较高［9］。HPLC法是比较理想的植物内源赤霉素的分析方法，具有较强的专一性，且重复性好，现已在多种植物激素的分析中得到应用［10-12］。

目前马铃薯中GA3的提取大多采用80%甲醇提取后，经旋转蒸发法浓缩，其提取过程复杂，且用时较长，不利于快速测定马铃薯中GA3的含量［13-14］。HPLC法在测定内源赤霉素时，经常会出现分离效果差、峰形不良及拖尾严重等问题，因此选择合适的GA3提取方法和色谱条件尤为重要。本试验采用高效液相色谱法对马铃薯块茎中的GA3含量进行测定，建立灵敏、简单、快速的马铃薯中GA3含量的测定方法，以期为进一步研究马铃薯萌芽过程中的GA3代谢与调控奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料与设备

1.1.1材料与试剂

马铃薯，品种为大西洋，由天津市西青区辛口镇第六埠村脱毒马铃薯微型种薯繁育基地提供；GA3标样，纯度≥98%，由美国Sigma公司生产；甲醇（色谱纯），由天津康科德化学试剂公司生产；1，2-二氯乙烷（色谱纯），由天津市津科精细化工研究所生产；冰乙酸（色谱纯），由天津市赢达稀贵化学试剂厂生产；浓盐酸（分析纯），由天津市化学试剂批发公司生产；试验用水为娃哈哈纯净水。

1.1.2仪器与设备

LC-20A日本岛津高效液相色谱仪（LC-20T二元梯度泵，SPD-M20A检测器，SIL-20A自动进样器），SPE C18固相萃取柱（规格：500 mg，6 mL），TUBE-MILL control试管研磨机，FD8-4西盟国际真空冷冻干燥机，Extrapid柱-盘式手动固相萃取仪，BDSThermo C18反相色谱柱。

1.2方法

1.2.1处理方法

马铃薯采收后立即运送至天津商业大学冷库，16℃愈伤一周后贮藏于10℃冷库中，每45 d取样进行测定。测定时将马铃薯从冷库中取出，每6个马铃薯为一组，用削皮器去皮（2mm左右）后切成1 cm3的方块混匀，取部分样品真空冷冻干燥72 h，取出后用试管研磨机粉碎，装入175mm×130mm×0.12mm规格的聚乙烯自封袋中密封保存，于-28℃冰箱中备用。试验重复3次。

1.2.2标准品的制备

精密称取GA3标准品5.0mg于5mL棕色容量瓶中，用50%的甲醇溶解后稀释至刻度，制得浓度为1mg/mL的溶液作为标准储备液，于-20℃冰箱中避光保存。

1.2.3样品前处理

马铃薯赤霉素的提取参照Pan等［11］的方法并稍作改动。称取真空冷冻干燥后的马铃薯粉末2.00 g（相当于鲜样7.50 g），加入10mL丙醇∶水∶浓盐酸= 2∶1∶0.002（V∶V∶V）的混合溶液，于4℃下振荡30min，加入10mL二氯乙烷，4℃下振荡30min后于4℃、12 000 r/min条件下离心15min，取下清液，并向残渣中加入2mL二氯乙烷，二次离心，合并下清液为粗提液。将粗提液真空冷冻干燥（-80℃，12 h），所得残留物加入5mL磷酸盐缓冲液（0.01mol/L，pH=3.5）中溶解，经预活化的C18柱（6mL甲醇活化后用6mL 80%甲醇平衡）过滤，以1mL的80%甲醇进行洗脱，并收集全部洗脱液，真空冷冻干燥后用流动相溶解残渣并定容至1mL，溶液经0.45μm滤膜过滤，滤液用于HPLC测定。

1.2.4色谱条件

BDSThermo C18反相色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇∶水=3∶7（V∶V）；流速：1.0mL/min；进样量：20μL；波长：235 nm；柱温：30℃。

1.2.5试验方案设计

1.2.5.1流动相的筛选

分别以甲醇∶水（用乙酸调节pH=3）=5∶5（V∶V）、4∶6（V∶V）、3∶7（V∶V）以及甲醇∶水=5∶5（V∶V）、4∶6（V∶V）、3∶7（V∶V）为流动相，在流速为1.0mL/min，进样量为20μL，检测波长为205 nm，柱温为30℃的色谱条件下对GA3标准品（10μg/mL）进行分离，筛选最佳流动相。

1.2.5.2流速的筛选

分别以0.8、1.0、1.5mL/min为流速，在流动相为甲醇∶水=3∶7（V∶V），进样量为20μL，检测波长为205nm，柱温为30℃的色谱条件下对马铃薯样品中的GA3进行分离检测，筛选最佳流速。

1.2.5.3波长的选择

分别以205、215、225、235 nm为检测波长，在流动相为甲醇∶水=3∶7（V∶V），流速为1.0mL/min，进样量为20μL，柱温为30℃的色谱条件下对马铃薯样品中的GA3进行分离检测，筛选最佳检测波长。

1.2.5.4内源激素的定性分析

将1.0mg/mLGA3储备液稀释至10μg/mL的标准溶液，采用“1.2.4”中的色谱条件对GA3标准溶液进行分离检测。

1.2.5.5标准曲线及检出限

向基质中分别加入浓度为3、10、20、30、40μg/mL的标准品，以基质加标浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行标准曲线的绘制。将GA3的标准品溶液逐级稀释后进样，根据3倍信噪比的峰响应值，计算出此方法检出限；根据10倍信噪比的峰响应值，得出定量限。

1.2.5.6回收率的测定和实际样品分析

按“1.2.3”所述方法进行马铃薯块茎中的GA3提取，并按照“1.2.4”中的色谱条件进行测定，在已测样品中加入2μg/g及4μg/g的标准品，测定GA3含量，计算加标回收率。利用“1.2.3”中的提取方法以及“1.2.4”中的色谱条件，分别对0、45、90 d的马铃薯样品进行GA3的提取测定。

2　结果与分析

2.1流动相的选择

流动相筛选试验发现，以甲醇∶水（用乙酸调节pH=3）=5∶5（V∶V）、4∶6（V∶V）、3∶7（V∶V）为流动相，对GA3标准品（10μg/mL）进行测定，分离效果不理想。由图1可以看出，选用不同比例的甲醇-水作为流动相，对GA3标准品进行分离，结果发现，以甲醇∶水= 5∶5（V∶V）或者4∶6（V∶V）为流动相时，色谱峰不能实现彻底分离（图1A，图1B）；而以甲醇∶水=3∶7（V∶V）为流动相时，液相色谱峰尖锐，且分离度高，重复性好（图1C）。因此本试验以甲醇∶水=3∶7（V∶V）为流动相。

2.2流速的选择

试验共考察了0.8、1.0、1.5mL/min三个流速，比较其对GA3样品分离效果的影响。通过检测发现，当流速为0.8mL/min时，GA3的保留时间为7.196min；当流速为1.5 mL/min时，GA3的保留时间缩短至3.615min，但受到样品中杂质的干扰，出现杂质峰与目标峰重叠现象严重的问题；当流速为1.0mL/min时，GA3的保留时间为5.424min，此时，杂质峰和目标峰可实现有效分离。经过筛选最终确定测定的最佳流速为1mL/min。

2.3波长的选择

由图2可见，在205 nm（图2A）、215 nm（图2B）、225 nm（图2C）检测波长下样品中杂质干扰性较强，不能实现GA3的有效分离；235 nm（图2D）下分离度最好，目标峰与样品中的杂峰均分离良好，色谱峰形对称。

2.4内源激素的定性分析

采用“1.2.4”中的色谱条件对GA3标准品进行分离。结果表明，GA3的保留时间为（5.424±0.072）min。

2.5标准曲线及检出限

为了减少基体效应的影响，本试验采用试样基体加标法绘制标准曲线来减小基质的干扰，结果如图3所示。经计算得出GA3的标准曲线回归方程为：y=3 386.5x+2 619.7，相关系数R2=0.999 1，线性关系良好，符合分析要求。该方法检出限为0.09mg/kg，定量限为0.12mg/kg。

2.6回收率的测定和实际样品分析

由表1可见，加标后回收率分别为100.50%和97.75%，相对标准偏差分别为1.54%和3.57%。GA3的平均回收率为99.13%，平均相对标准偏差为2.56%，符合定量分析的要求，并且数据误差小，说明上述样品提取方法及色谱测定条件是可行的。

表1　GA3加标回收率Table 1　Standard addition recovery rate of GA3

马铃薯贮藏期间GA3的变化见图4。由图4可以看出，马铃薯中GA3含量随贮藏时间的延长呈先上升后下降的趋势，周长艳［15］对4种窖藏方式下马铃薯中GA3变化情况进行了研究，结果表明，4种窖藏方式下马铃薯中GA3含量均呈先上升后下降的趋势，这与本试验结果相似。马铃薯在休眠期时，GA3含量随贮藏时间的延长逐渐升高，当含量升高至一定的阈值时会引起马铃薯块茎休眠解除［7］。本试验测定马铃薯中GA3含量最高为3.52μg/g，最低为2.04μg/g。

3　结论

本试验采用高效液相色谱法对马铃薯中的GA3含量进行检测。结果表明，在以甲醇∶水=3∶7（V∶V）为流动相，流速1.0 mL/min，进样量20μL，检测波长为235 nm，柱温为30℃条件下能实现马铃薯中GA3的有效分离，方法检出限为0.09mg/kg，定量限为0.12mg/kg。该方法能满足马铃薯贮藏过程中GA3变化的检测要求，为进一步研究马铃薯中的激素代谢奠定了基础。

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Determ ination of Gibberellin Acid in Potato by High Performance Liquid Chromatography

LEIJing1，XU Li-xing1，CUIXin-yi2，GUANWen-qiang1，*，LINing2，WANG Yan-bin1
（1.Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology，CollegeofBiotechnology and Food Sciences，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China；2.Tianjin AgriculturalCollege，DepartmentofHorticulture，Tianjin 300384，China）

A high performance liquid chromatographic（HPLC）method was developed for the determination of gibberellin acid（GA3）in potato.The chromatographic separation was carried out on a reverse phase C18 column using methanol∶water=3∶7（V∶V）.The flow ratewas1.0mL/min，the sample injection volumewas 20μL，and the detection wavelength was235 nm.The average recovery ofGA3was99.13%.The limitofdetectionwas0.09mg/kg，and the limit ofquantitywas0.12mg/kg.It showed a simple and convenientmethod for rapid，accurate separation and determination gibberellin acid in potato.

high performance liquid chromatography；gibberellin acid；potato；determination

S532

A

10.3969/j.issn.1009－6221.2016.04.022

国家自然科学基金项目（31271949）

雷静（1991—），女，汉族，硕士在读，研究方向：农产品加工与贮藏。

关文强，博士，教授，研究方向：农产品加工与贮藏。

2016-05-26