高效液相色谱梯度洗脱法同时测定冠心苏合滴丸中5个成分的含量

袁杰，张新艳

(1.辽宁中医药大学附属医院制剂中心,辽宁 沈阳　110032；2.辽宁省军区沈阳第一干休所卫生所，辽宁 沈阳　110032)



高效液相色谱梯度洗脱法同时测定冠心苏合滴丸中5个成分的含量

袁杰1，张新艳2

(1.辽宁中医药大学附属医院制剂中心,辽宁 沈阳110032；2.辽宁省军区沈阳第一干休所卫生所，辽宁 沈阳110032)

目的建立高效液相色谱(HPLC)梯度洗脱法同时测定冠心苏合滴丸中的马兜铃酸Ⅰ、荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷含量。方法采用Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇(A)-0.5%冰醋酸溶液(B)为流动相，进行梯度洗脱，流速0.9 mL·min-1，柱温30 ℃，波长切换法检测(0～21 min，390 nm，马兜铃酸Ⅰ；21～60 min，338 nm，荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷)；进样量为10 μL。结果马兜铃酸Ⅰ、荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷5个成分的线性范围分别为4.16～83.20 mg·L-1(r=0.999 6)、6.35～127.00 mg·L-1(r=0.999 8)、4.98～99.60 mg·L-1(r=0.999 2)、14.33～286.60 mg·L-1(r=0.999 7)、16.37～327.40 mg·L-1(r=0.999 4)；平均加样回收率及相应的RSD分别为98.26%(1.40%)，99.23%(1.35%)，97.90%(1.58%)，96.97%(1.14%)，99.11%(1.58%)。结论该文建立的方法符合方法学验证要求，可用于冠心苏合滴丸中的5个指标性成分的同时定量测定。

中草药/分析;滴丸剂;心绞痛;色谱法,高压液相

冠心苏合滴丸具有理气宽胸，止痛的功效，临床上主要用于心绞痛，胸闷憋气等病症的治疗，该制剂是由青木香、檀香、苏合香、冰片、乳香(制) 等5味中药材加工而成的中药复方滴丸剂，收载于《卫生部颁药品标准》中药成方制剂第十二册，标准仅规定了性状、理化鉴别，无其它定量检测项目[1]，也未检索到对该制剂中所含冰片外的其他成分进行定量测定的文献报道，不能较全面地控制本品的质量。为更好地确保冠心苏合滴丸质量，提高冠心苏合滴丸的质量标准，本文作者采用HPLC法同时测定冠心苏合滴丸马兜铃酸Ⅰ、荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷的含量，可有效地提高冠心苏合滴丸的质量标准，为其质量监管提供科学依据。

1　仪器与试药

1.1仪器高效液相色谱仪(HP1100型，美国Waters)，紫外检测器(Agilent1100型，安捷伦科技有限公司)；电子天平(岛津AUW220D型，0.01 mg，日本岛津公司)；超声波清洗器(KQ3200B型，昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试药样品：冠心苏合滴丸，购于北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂(每丸重40 mg，批号：15290004、15290009、15290017)；试剂：甲醇为色谱纯，冰醋酸为分析纯；对照品：马兜铃酸 I(110746-201510，含量：99.1%)、荭草苷(111777-201302，置五氧化二磷干燥器中减压干燥 12 h后使用，含量：97.9%)、异荭草苷(110769-200405，含量：94.0%)、牡荆苷(111687-200602，置五氧化二磷减压干燥器中干燥 12 h以上使用)均购于中国食品药品检定研究院，异牡荆苷对照品(29702-25-8，含量：98.0%，-4℃下避光干燥保存)购于上海纯优生物科技有限公司。

2　方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1供试品溶液

冠心苏合滴丸适量，研细，取约1.0 g，精密称定，置50 mL量瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补充减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得冠心苏合滴丸供试品溶液。

2.1.2混合对照品溶液

精密称取对照品马兜铃酸Ⅰ、荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷各适量，分别置5个不同的20 mL量瓶中，用70%乙醇分别溶解并稀释至刻度，摇匀，即得单一浓度的对照品储备溶液(马兜铃酸Ⅰ对照品0.416 g·L-1、荭草苷对照品0.635 g·L-1、异荭草苷对照品0.498 g·L-1、牡荆苷对照品1.433 g·L-1、异牡荆苷对照品1.637 g·L-1)。

再分别依次量取上述各对照品储备液：2.5、1.0、2.5、5.0和5.0 mL，置同一50 mL量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液(马兜铃酸Ⅰ对照品0.0208 g·L-1、荭草苷对照品0.0127 g·L-1、异荭草苷对照品0.0249 g·L-1、牡荆苷对照品0.1433 g·L-1、异牡荆苷对照品0.1637 g·L-1)。

2.1.3阴性对照溶液

按照冠心苏合滴丸工艺方法分别制备青木香阴性样品和檀香阴性样品，按照“2.1.2”项下方法制备青木香阴性对照溶液和檀香阴性对照溶液。

2.2色谱条件色谱柱：Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：0.9 mL·min-1；进样量为10 μL；柱温：30 ℃；流动相A：甲醇，流动相B：0.5%冰醋酸溶液，梯度洗脱[2-8](0～15 min，22.0%A；15～21 min,22.0%A→31.0%A;21～36 min,31.0%A;36～54 min,31.0%A→43.0%A;54～60 min,43.0%A→22.0%A)；0～21 min时在390 nm[9]波长下检测马兜铃酸Ⅰ，21～60 min在338 nm[6,10-11]波长下检测荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷。

2.3含量测定方法学考察

2.3.1线性关系考察

分别精密吸取上述对照品储备液各0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL，将其置于10 mL量瓶中并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得到一系列浓度的混合对照品溶液，按照上述测定方法进行测定，采用质量浓度X作为横坐标，测得的峰面积Y作为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程,如表1所示。

2.3.2专属性实验

分别精密吸取阴性对照溶液、混合对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪中，在上述色谱条件下依法进行测定。试验结果表明，各阴性对照溶液的色谱图中，在所测马兜铃酸Ⅰ、荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷5个成分对应的位置无干扰，表明该方法专属性良好，色谱图见图1。

表1　线性关系实验结果

2.3.3重复性试验

取同一批号15290004的冠心苏合滴丸样品适量，研细，取细粉6份，按上述供试品溶液制备方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行测定，分别计算马兜铃酸Ⅰ、荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷的含量，并计算所测5个组分含量的RSD，结果所测5个组分的RSD依次为1.23%、1.54%、1.08%、0.99%和0.86%。结果表明本方法重复性良好。

2.3.4仪器精密度试验

取上述混合对照品溶液，按上述规定的色谱条件重复进样6次，记录马兜铃酸Ⅰ、荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷的峰面积，分别计算这5个组分峰面积的RSD值，其RSD依次为1.06%、1.15%、0.98%、0.83%和0.77%。结果显示仪器精密度良好。

2.3.5供试品溶液的稳定性

取重复性项下的一份供试品溶液，在室温下放置0 、1、2、4、8、12 h来评价供试品溶液的稳定性，按上述色谱条件及测定方法，测定马兜铃酸Ⅰ、荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷的峰面积值，求得这5个组分的峰面积的RSD依次为0.98%、1.04%、0.88%、0.85%和0.73%，供试样品溶液制备后12 h内是较稳定的。

2.3.6加样回收率试验

取批号为15290004已知含量的冠心苏合滴丸适量，称定6份，每份0.5 g，精密称定，置50 mL量瓶中，精密加入“2.1.2”项下制备的混合对照品溶液25 mL、70%乙醇25 mL，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补充减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，作为加样回收样品试液。按照上述色谱条件及上述检测方法，计算这5个组分的回收率及RSD，结果见表2。

2.4样品的测定取三批冠心苏合滴丸，按上述制备方法制备供试品溶液，在上述的色谱条件下进样测定，结果见表3。

表3　含量测定结果/mg·g-1

3　讨论

本实验首次建立了 HPLC 梯度洗脱法同时测定冠心苏合滴丸中5 个成分含量的方法，该方法操作简便、灵敏度高、准确性好。

本文作者在研究供试品的制备方法时，提取方法分别考察了加热回流提取与超声提取两种方法，结果显示两种方法的提取率差异无统计学意义，选择操作简便的超声提取法为实验提取方法；对不同溶剂下(60%、70%、80%、90%乙醇)样品超声提取法所测各成分马兜铃酸Ⅰ、荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷含量的提取率进行考察，结果70%乙醇提取效率略高，故将70%乙醇确定为实验提取溶剂。提取时间分别选择超声20、30、40 min进行考察，结果超声处理30 min和40 min,所测各成分马兜铃酸Ⅰ、荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷差异不大，但明显高于20 min的提取效果。最终确定为“2.1.1”项下的制备方法，即70%乙醇超声处理30 min作为供试品溶液制备的最佳提取方案。

注：样品(A)、对照品(B)、青木香阴性(C)、檀香阴性(D)

表2　马兜铃酸Ⅰ、荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷回收率

4　小结及展望

为提高对冠心苏合滴丸中所测5个成分马兜铃酸Ⅰ、荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷检测的灵敏度和准确度,本文采用波长切换联合梯度洗脱法实现对所测5个成分的同时测定,为冠心苏合滴丸的质量控制增加了方法手段，研究结果为控制冠心苏合滴丸的质量和药品标准的进一步提高提供了数据支持。本方法测定需要使用5个组分对照品，用量相对较大，为简化检测方法，降低检验成本，一测多评法在本样品中的可行性还有待进一步研究。

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Simultaneous determination of contents of five components in Guanxin Suhe Dripping Pills by HPLC with gradient elution method

YUAN Jie1,ZHANG Xinyan2

(1.MedicalCenterAgents,TheAffiliatedHospitalofLiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang,Liaoning110032,China;2.HealthClinic,ShenyangFirstSanatoriumforRetiredOfficersofLiaoningMilitaryRegion,Shenyang,Liaoning110032,China)

ObjectiveTo develop an HPLC with gradient elution method for determination of the contents of aristolochic acid Iorientin,isoorientin,vitexin and isovitexin in Guanxin Suhe Dripping Pills simultaneously.MethodsThe Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm) chromatographic column was adopted;the mobile phase was methanol(A)-0.5% glacial acetic acid solution(B) with gradient elution at a flow rate of 0.9 mL·min-1.Sample quantity was 10 μL,the column temperature was set at 30 ℃,and the detection wavelengths were 390 nm(0～21 min,aristolochic acid I),338 nm(21～60 min,orientin,isoorientin,vitexin and isovitexin).ResultsGood linear relationships of aristolochic acid I,orientin,isoorientin,vitexin and isovitexin,were found in the ranges of 4.16～83.20 mg·L-1(r=0.999 6),6.35～127.00 mg·L-1(r=0.999 8),4.98～99.60 mg·L-1(r=0.999 2),14.33～286.60 mg·L-1(r=0.999 7),and 16.37～327.40 mg·L-1(r=0.999 4),respectively.The average recoveries and the corresponding RSD were 98.26%(1.40%),99.23%(1.35%),97.90%(1.58%),96.97%(1.14%),and 99.11%(1.58%),respectively.ConclusionsThis method is consistent with the method validation requirements,and can simultaneously determine the above 5 index components of Guanxin Suhe Dripping Pills．

Drugs,Chinese herbal/analysis;Drop pills;Angina pectoris;Chromatography,high pressure liquid

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.09.010

2016-4-11，

2016-07-09)