肝细胞癌患者血清中循环无细胞DNA、甲胎蛋白及a-L-岩藻糖苷酶联合检测的意义

陈恳，丁益宏，朱郁飞，魏群，李峰，张弘

(1.如皋市人民医院消化内科，江苏 如皋　226500；2.南通大学附属医院消化内科，江苏 如皋　226000)



肝细胞癌患者血清中循环无细胞DNA、甲胎蛋白及a-L-岩藻糖苷酶联合检测的意义

陈恳1，丁益宏1，朱郁飞1，魏群2，李峰2，张弘2

(1.如皋市人民医院消化内科，江苏 如皋226500；2.南通大学附属医院消化内科，江苏 如皋226000)

目的探讨循环无细胞DNA(cfDNA)在肝细胞癌(HCC)中检测的价值及其与甲胎蛋白(AFP)、a-L-岩藻糖苷酶(AFU)联合检测的临床诊断价值。方法收集39例HCC患者血清以及45例正常对照血清，采用分支DNA(branched DNA,bDNA)技术检测血清中cfDNA的浓度，同时采用化学发光法检测血清中AFP的浓度，比色法测定血清AFU的活性，并讨论这三种生物标志物联合检测的意义。结果39例HCC患者血清中有 22例cfDNA含量增高，45例正常对照血清中有2例cfDNA含量增高，HCC患者血清cfDNA阳性表达率均显著高于正常对照者(P<0.05)；cfDNA与AFP、AFU的一项或者两项联合检测敏感性分别为71.8%、87.2%、89.7%，明显高于单独一项检测敏感性分别为56.4%、53.8%、66.7%,差异有统计学意义(P<0.05)。经相关性分析，cfDNA、AFP与AFU这三种生物标志物均无相关性。结论定量分析cfDNA的方法用于HCC的检测是一种敏感、有效的方法，与AFP、AFU 联合检测可以大大提高HCC的临床诊断。

癌,肝细胞;无细胞系统;α-L-岩藻糖苷酶;甲胎蛋白类;癌症早期检测

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率占肿瘤发病率中的第3位，恶性肿瘤死亡率排在第2位。肝癌未能切除者1年生存率低于30%，即使行肝癌根治术，五年复发率达80%左右，小肝癌的复发率也高达40%～50%，可见其治疗的关键在于早期发现和早期诊断[1]。目前临床常用的诊断指标有甲胎蛋白(a-fetoprotein，AFP)、GGT-Ⅱ、a-L-岩藻糖苷酶(a-L-fucosidase，AFU)、酸性同工铁蛋白等[2-3]，迄今为止，AFP仍然是诊断HCC最特异的标志，其在诊断、判断疗效、估计预后、预防复发中有肯定的作用。但是单靠AFP不能诊断所有的HCC，有30%左右的HCC患者AFP呈阴性。AFU、GGT-Ⅱ等在AFP阴性HCC的诊断有辅助意义，但仍不能取代AFP在HCC诊断中的意义，故临床上需要一种优于或者类似于AFP的检测指标来提高HCC的诊断率。本研究以分支DNA技术为基础的Alu含量测定方法，用于在HCC患者血清中定量检测循环无细胞DNA(circulating free cell DNA，cfDNA)的含量，并评估其临床诊断价值。同时，采用化学发光法检测同批患者血清中AFP的浓度，以及比色法测定血清中AFU的活性，探讨这三种生物标志物对HCC诊断的相互关系，并讨论这三种生物标志物联合检测的意义。

1　材料和方法

1.1材料选取如皋市人民医院2011年5月至2011年10月病史资料完备，经临床和影像学诊断为肝细胞癌患者血清标本39例，男32例，女7例，年龄40～85岁;随机选取如皋市人民医院体检各项指标均正常的人员血清标本45例，男36 例，女 9例，年龄 28～83岁。于清晨空腹条件下采集血液，离心后将血清吸入eppendorf管，分装后置于-80℃冰箱保存备用。

1.2主要试剂QuantiGene 2.0 DNA Assay(美国Panomix 公司)；甲胎蛋白试剂盒 ARCHITECT AFP Reagent Kit(美国雅培制药有限公司)；AFU检测试剂盒购自上海海军医学研究所生物技术中心。

1.3cfDNA的定量检测所有血清标本取5 μL，用双蒸水稀释到100 L。人类基因组DNA标准液用TE缓冲液进行倍比稀释，浓度分别为0、50、100、200、400 μg·L-1。检测样本和标准品均稀释后置于干锅95℃ 5 min加热，使DNA解链成单链，迅速放入冰上，保持单链状态。96孔板上每孔加入含有50%溶菌混合液和1 g·L-1蛋白酶K的90 μL WPS和10 μL检测样本(均做三孔检测)，用锡箔纸封闭，置于杂交箱55℃过夜，用洗涤缓冲液洗涤3遍96孔板后，依次加入前放大探针(preamplifer probe)、放大探针(amplifer probe)，每次55 ℃1 h，洗涤3次，然后加入标记探针(labeled probe)，50 ℃1 h，洗涤3次，最后一次洗涤后，加入碱性磷酸酶底物催化剂dioxetane，用锡箔纸封闭，室温下静置5～10 min，显影发光标记，用一种微孔板发光计检测出每孔光子读数。以标准品的浓度为横座标和检测出的光子数为纵座标，绘制标准曲线，并得出浓度与光子数相关方程式。然后，按方程式计算每孔的cfDNA的浓度，再乘以20得出每孔稀释前的cfDNA含量。

1.4AFP的定量检测血清标本AFP的检测采用化学发光免疫分析法，按雅培公司甲胎蛋白试剂盒(ARCHITECT AFP Reagent Kit)说明书操作，根据校准品剂量-反应曲线计算各标本的浓度值。

1.5AFU的定量检测血清标本AFU的检测采用比色法，按上海海军医学研究所生物技术中心试剂盒说明书操作，计算AFU活性。

1.6结果判读

1.6.1cfDNA参考值

根据标准曲线求得方程式，计算每个样本的cfDNA含量，做受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)，选取灵敏度和特异度最高的约登指数[4](Youden's index = Sensitivity+Specificity-1)为最佳筛查阳性界值(cut-off值)。故大于等于此值为阳性，小于此值为阴性。

1.6.2AFP参考值

根据中国抗癌协会制定的肝癌的临床诊断和分期标准，排除妊娠、生殖系统的胚胎肿瘤、活动性肝炎、转移性肝癌，血清AFP含量大于等于400 μg·L-1为阳性，小于400 μg·L-1为阴性。

1.6.3AFU参考值

血清AFU活性(μmol·L-1·h-1)=(A测定管-A对照管)/平均A标准管×400。大于650 μmol·L-1·h-1为阳性，550～650 μmol·L-1·h-1为可疑，小于550 μmol·L-1·h-1为阴性。

2　结果

2.1标准曲线的绘制将人类基因组DNA标准液400 μg·L-1做倍比稀释，浓度分别为0、50、100、200、400 μg·L-1。每个浓度去3孔光子数的平均值，以标准品的浓度和检测出的光子数绘制标准曲线，得出方程式Y=610.01X，R2=0.961 3(图1)。

图1　循环无细胞DNA标准曲线

2.2cfDNA定量检测的结果39例HCC患者血清cfDNA含量最高12 866.8 μg·L-1，最低0 μg·L-1，中位数557.59 μg·L-1。45例正常对照者血清cfDNA含量最高 569.2963 μg·L-1，最低0 μg·L-1，中位数240.07 μg·L-1。采用u检验，u=3,4963>u0.01=2.58，得P<0.01两者比较差异有统计学意义，(图2)。根据ROC曲线，cfDNA诊断HCC的ROC曲线下面积(AUC)为0.742±0.058，最佳分界值为509.9774 μg·L-1。当以cfDNA≥509.9774 μg·L-1来预测HCC，其诊断的敏感度为56.4%、特异度为95.6%、准确度为77.4%、阳性预测值为91.7%、阴性预测值为71.7%、阳性似然比为12.692、阴性似然比为0.048、Youden指数为0.520。cfDNA浓度为509.9774 μg·L-1时，Youden指数取最大值，故将509.9774 μg·L-1定为阳性界定值。

图2　39例肝细胞癌患者血清和45例健康对照者血清循环无细胞DNA水平

2.3AFP和AFU定量检测的结果39例HCC患者血清AFP含量最高>10 000 μg·L-1，最低3.92 μg·L-1，阳性率为53.8%(21/39)。45例正常人血清AFP含量最高526.10 μg·L-1,最低1.31 μg·L-1l，假阳性率为8.9%(4/45)。两样本均数的比较采用u检验，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。

39例HCC患者血清AFU含量最高2366 μg·L-1，最低362 μg·L-1，阳性率为66.7%(26/39)。45例健康人血清AFU含量最高792 μg·L-1，最低121 μg·L-1，假阳性率为24.4%(11/45)。两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4cfDNA与AFP、AFU相关性的比较用SPSS13.0绘制散点图，计算Person相关系数分析三个指标两两之间的相关性。经Pearson相关系数分析，cfDNA与AFP相关系数r=0.243，t=1.524，P>0.05，故cfDNA与AFP没有相关关系。经Pearson相关系数分析，cfDNA与AFU相关系数r=-0.0735，t=0.448，P>0.05，故cfDNA与AFU没有相关关系。经Pearson相关系数分析，AFP与AFU相关系数r=-0.085，t=0.537，P>0.05，故AFP与AFU没有相关关系。

2.5cfDNA联合AFP和AFU对HCC联合检测其诊断效率与cfDNA 、AFP或AFU单独检测HCC比较，有不同程度的提高(表2)。

表1　循环无细胞DNA、AFP和AFU对肝细胞癌的诊断价值评价(%)

注：与cfDNA+AFP组比较,aP<0.05；与cfDNA+AFU组比较,bP<0.05；与cfDNA+AFP+AFU组比较,cP<0.05。

3　讨论

循环无细胞DNA(cfDNA)是存在于体液中的碎裂的核酸片段，可以在健康人和患者的血清中检测到，cfDNA在体液中处于一种动态平衡过程，与很多疾病密切相关，包括系统性红斑狼疮、糖尿病、脑卒中、风湿性关节炎、心肌梗死、肺栓塞、先兆子痫、Whipple’s综合征和各种恶性肿瘤[5]，研究发现严重损伤、器官衰竭和多器官功能障碍可导致释放到血浆中的cfDNA的含量增加。器官移植的病人cfDNA水平也会升高[6]。胎儿的cfDNA可以在母体的血浆中检测到，并且可以用于胎儿发育异常的产前诊断[7]。外伤和烧伤也可以导致cfDNA释放到血液循环中[8]。多数研究报道，在各种恶性和良性疾病患者血清中cfDNA水平明显高于健康对照者，在健康人中，可以推测循环DNA起源于淋巴细胞或其他有核细胞，但是在恶性肿瘤中的起源仍然未知。

关于HCC患者血清中cfDNA水平的研究，尚有一些报道。HBV携带者血清cfDNA水平显著高于正常对照者血清水平[9]。Ren等发现血清cfDNA水平与HCC的预后呈负相关,大多数病例与HBV感染有关，表明cfDNA可能是预测HBV相关HCC的前兆性标记物。cfDNA较易从循环中分离出来，因此cfDNA是一种潜在的非侵袭性的肿瘤标记物[10]。cfDNA水平高的HCV相关HCC患者经肝切除术后生存时间明显短于cfDNA水平较低患者,血清cfDNA水平与HCV相关HCC的远处转移相关[11]。本研究结果发现,39例HCC患者血清中cfDNA含量明显高于45例正常对照血清中含量，其中，HCC伴肝内外转移者cfDNA含量大幅度增高，男性患者对cfDNA含量也有较大影响，可见，肝内外转移和性别均与HCC密切相关。提示血清cfDNA含量的升高与肿瘤的分化程度和是否发生转移有关，推测可以在HCC的病情监测中起到一定的作用。

现有的定量血清中cfDNA的方法主要为RT-PCR技术。由于血循环中的DNA是一种存在于体液中的细胞外游离状态的DNA，与组织和细胞中的DNA不同，是游离于细胞之外的DNA，不含有细胞结构，因此血清中的cfDNA含量极少，从中提取游离DNA受到限制，提取的浓度和纯度不容易达到理想的效果。分支DNA杂交技术是本试验采用新近发展起来的一项技术，即分支DNA信号放大系统，是一种人工合成的分支DNA，分支DNA的分支可结合多个酶标记物，从而将捕获的靶标信号放大，以便进行检测。此技术无需提取血清游离DNA，直接以血清为检测样本，检测重复序列Alu，对两组中的血清中cfDNA进行定量分析。Alu家族是短散在重复序列中最大的一个家族，每个元件长约300 bp，具有很高的同源性(70%～98%)[12]。在Alu元件第170位置左右有一段序列AGCT，能被限制性内切酶Alu识别并切割(AG↓CT)，因此得名。目前的研究表明[13]，Alu序列具有独特的结构特征及生理功能，与多种恶性肿瘤相关。Alu序列之间发生的同源重组导致基因的缺失、重复，染色体异位导致的基因重排以及转录水平的改变均与人类的疾病相关。本试验中，应用bDNA技术，只放大杂交信号，不扩增靶序列，操作简便、经济、省时，有很好的可重复性，可以作为检测HCC的一种很好的检测方法。

在众多的HCC标记物中，一般认为，AFP是HCC相对特异的肿瘤标志物，AFP持续升高是发生HCC的危险因素。AFP现已广泛用于HCC的普查、诊断、判断治疗效果、预测复发[14]。AFP也可见于其他癌症,如:睾丸癌、畸胎瘤以及胃癌，胰腺癌等。但是单靠AFP不能诊断所有HCC，因为尚有30%左右HCC病人AFP阴性。在某些非恶性肿瘤病变也可存在假阳性：如病毒性肝炎，肝硬化的也会升高，妊娠妇女的血和尿中的AFP也会持续升高，但升高不如HCC明显，大多小于300 μg·L-1。AFU是一种广泛存在于人体组织中的溶酶体酸性水解酶，以肝肾等组织活性较高。关于AFU在HCC患者血清中含量升高的机理，有研究认为是HCC时AFU合成增加，但也有研究认为是肝癌细胞产生了一种AFU抑制剂，使其对底物水解能力下降，引起底物堆积及AFU含量代偿性增加。在肝细胞癌中，AFU可以作为一种有效的肿瘤标记物[15-16]。本实验中，HCC患者血清AFP含量最高>10 000 μg·L-1，最低3.92 μg·L-1，中位数392.07 μg·L-1，正常人血清AFP含量最高526.10 μg·L-1,最低1.31 μg·L-1，中位数6.02 μg·L-1。两者比较有显著性差异。HCC患者血清AFU含量最高2 366 μg·L-1，最低362 μg·L-1，中位数744 μg·L-1，正常人血清AFU含量最高792 μg·L-1，最低121 μg·L-1，中位数431 μg·L-1。两者比较亦有差异有统计学意义。可以得出，HCC患者血清中AFP含量、AFU含量较正常人血清中含量均明显增高。

相关分析是对现象之间的相关关系的方向和程度进行分析。本实验中，采用SPSS13.0绘制散点图，cfDNA、AFP和AFU三个指标，两两作图，得出相关点分布状况的图形。本实验中，cfDNA与AFP相关系数r=0.243，P>0.05，故cfDNA与AFP没有相关关系；cfDNA与AFU相关系数r=-0.0735，P>0.05，故cfDNA与AFU没有相关关系；AFP与AFU相关系数r=-0.085，P>0.05，故AFP与AFU没有相关关系。可以得出，cfDNA与AFP、AFU可以作为不相关的独立的检测指标，用于HCC的临床诊断。

任何一个诊断指标，都具备三个最基本的特征，即敏感性、特异性和准确性。本实验中，在敏感性方面AFU为66.7%最高，cfDNA与AFP分别为56.4%和53.8%，在特异性方面，AFU仅为75.6%，远远低于cfDNA为95.6%和AFP为91.1%，准确性cfDNA为77.4%，AFP为73.8%，AFU为71.4%。综合评价，三者准确性相似，无明显区别，AFU虽敏感性最高，但特异性很低，cfDNA和AFP敏感性较低，但特异性好。cfDNA联合AFP或cfDNA联合AFU两项检测检测，检测特异性下降，但敏感性显著提高，准确性相似，cfDNA联合AFP、AFU三项检测，检测敏感性稍有提高，特异性下降，准确性相似，综合考虑病人经济负担等因素，我们认为两项检测优于三项检测。因此，cfDNA与AFP、AFU联合检测可以大大提高HCC阳性检出率，具有重要的临床应用价值。

总之，cfDNA用于检测HCC具有较高的敏感性和特异性，其临床诊断价值可与AFP媲美，且与AFP、AFU没有相关性，联合其中一项或两项检测可大大提高HCC的诊断率。

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Significance of combined detection with CfDNA,AFP and AFU in the diagnosis of hepatocelluar carcinoma

CHEN Ken，DING Yihong，ZHU Yufei，et al

(DepartmentofGastroenterology，RenminHospital,Rugao,Jiangsu226500,China)

ObjectiveTo investigate the value of circulating free cell DNA(cfDNA)for the diagnosis of hepatocellular carcinoma(HCC),and to explore the value of combined detection of cfDNA,AFP and AFU for the clinical diagnosis.MethodsSerum samples from 39 HCC patients and 45 normal controls were collected.Branched DNA(bDNA) was used to detect the level of cfDNA,while AFP (a-fetoprotein)and AFU (a-L-fucosidase)were detected by chemiluminescence and colorimetry respectively.The significance of combined detection of the three biomarkers was discussed.ResultscfDNA level was increased in 22 of the 39 HCC samples and 2 of the 45 normal controls.cfDNA level in HCC samples was significantly higher than that in normal controls (P<0.05).The sensitivities of combined detection with one item(cfDNA and AFP，cfDNA and AFU),and with two items(cfDNA ,AFP and AFU) were 71.8%,87.2% and 89.7% versus 56.4%,53.8% and 66.7% for cfDNA and AFP,AFU alone respectively,the difference being statistically significant(P<0.05).By the correlation analysis,there was no significant correlation between cfDNA,AFP and AFU in the detection of HCC.ConclusionsQuantitative analysis of cfDNA is sensitive and feasible,and combined detection of cfDNA with AFP or AFU or both can improve the diagnostic sensitivity for HCC.

Carcinoma,hepatocellular;Cell-free system;alpha-L-Fucosidase;alpha-Fetoproteins;Early detection of cancer

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.09.029

2016-02-23，

2016-04-07)