三叶木通光敏色素A基因的序列及表达分析

李慧丽， 韩兴杰， 廖　亮， 徐玲玲*

( 1. 江西农业大学 园林与艺术学院， 南昌 330045； 2． 九江学院 药学与生命科学学院， 江西 九江 332000 )



三叶木通光敏色素A基因的序列及表达分析

李慧丽1,2， 韩兴杰2， 廖亮2， 徐玲玲2*

( 1. 江西农业大学 园林与艺术学院， 南昌 330045； 2． 九江学院 药学与生命科学学院， 江西 九江 332000 )

光敏色素(phytochrome，简称PHY)是植物体内最重要的光受体，参与调节植物种子萌发、幼苗生长、茎的伸长、子叶伸展直至开花控制等许多生理过程。该研究通过RT-PCR方法首次从三叶木通(Akebiatrifoliata)中获得了编码光敏色素A的cDNA序列(命名为AktrPHYA1，GenBank登录号为KP864055)。结果表明：该序列由3 496 bp组成，包含一个3 426 bp的完整开放阅读框，编码1 141个氨基酸。AktrPHYA1编码的蛋白N端为光感受区域，包括一个GAF结构域、一个PHY结构域；C端为光调节区域，C端包括两个PAS结构域、一个组氨酸激酶A结构域和一个类似组氨酸激酶的ATP激酶结构。同源蛋白比对显示，AktrPHYA1与耧斗菜、荷花的同源蛋白序列一致性分别为83%和82%。遗传进化树分析表明，单子叶植物和双子叶植物的光敏色素A基因分别聚为两支；在双子叶植物中，AktrPHYA1与耧斗菜、荷花PHYA聚在一起，说明三叶木通与耧斗菜、荷花遗传关系较近。AktrPHYA1在三叶木通茎、叶片、雄花、雌花、种子中均有表达，且在种子中表达最强，在叶片中表达量最低。AktrPHYA1的组织表达谱暗示了其在植物中可能的功能。该研究结果为三叶木通光敏色素A基因的功能研究奠定了基础。

三叶木通, 光敏色素A, 序列分析, 表达分析

光是植物生长发育的一个重要环境因子，它不仅影响植物的光合作用，而且还作为信号分子调节植物的生长发育。植物对光信号的接受和转导依靠不同的光受体完成，目前已知的光受体有光敏色素(phytochrome)、隐花色素(cryptochrome)、向光蛋白(photochopin)和UV-B(光受体)(Lin & Todo, 2005；Rockwell et al, 2006)。光敏色素是植物体内最重要的光受体，参与调节植物种子萌发、幼苗生长、茎的伸长、子叶伸展直至开花控制等许多生理过程(Weller et al, 2015；Kircher , 2011)。

被子植物中光敏色素基因是以多基因家族形式存在的(Clack et al, 1994；Sharrock & Clack, 2002；Abdurakhmonov et al, 2010)，按照光敏色素稳定性可以分为两类：一为光不稳定型，主要是PHYA；另一类为光稳定型，主要是PHYB-PHYE。自从1989年拟南芥PHYA全长cDNA序列被克隆以来(Sharrock & Quail, 1989)，陆续得到了各种植物PHYA的全长cDNA序列，包括苜蓿(杨玲玲等, 2008)、玉米(马燕斌等, 2010a)、小麦(马燕斌, 2010b)等。过量表达烟草PHYA基因的烟草叶面积明显增大(Robson et al, 1996)，在叶部特异表达拟南芥PHYA基因的转基因水稻穗变大，产量增加(Kong et al, 2004；Ajay et al, 2006)，将水稻PHYA转入拟南芥，结果表明PHYA促进种子萌发、抑制下胚轴伸长、促进花期提前，转基因的白化苗中叶绿素含量提高(陈春峰, 2011)。因而对光敏色素基因的研究具有重要意义。

三叶木通(Akebiatrifoliata)是木通科木通属的一种野生藤本植物，广泛分布于中国20多个省市。其茎藤、果实均可入药，果实中富含蛋白质、氨基酸、可溶性糖、维生素、有机酸及多种矿质元素(张宁, 2010；仲伟敏等, 2015)，三叶木通籽含有油酸、亚油酸、棕榈酸等不饱和脂肪酸(孙翔宇等, 2012)。因此，三叶木通可作为药食兼用的宝贵资源。本研究获得了三叶木通光敏色素PHYA的cDNA序列并对其编码的蛋白序列和结构特征进行了分析，为进一步研究其功能奠定了的基础。

1　材料与方法

1.1 试验材料

取新鲜的三叶木通(Akebiatrifoliata)茎、叶片、雄花、雌花、种子等组织材料，液氮速冻后于-80 ℃冰箱储存。

1.2 方法

1.2.1 三叶木通总RNA的提取不同组织材料于液氮中充分研磨至粉末，总RNA的提取采用CTAB法(刘洋等，2006)。

1.2.2 三叶木通 cDNA的获得以三叶木通总RNA为模板，使用RevertAid逆转录试剂盒(#K1621，Fermentas)进行逆转录反应，获得cDNA第一链。

1.2.3三叶木通PHYA1的扩增和序列测定以cDNA为模板，用一对引物(F：5′-TTCGAGTTTGTTCTGTGTGGTTTTATAGAGATT-3′，R：5′-ACATAACAAAACCAACCAAAGATTGCTACG-3′)进行PCR扩增。PCR反应体系10 μL，其中包括1 × LA Taq Buffer，0.4 mmol·L-1dNTP Mixture，上、下游引物各0.2 mmol·L-1，0.4 μL LA Taq DNA聚合酶，0.2 μL cDNA模板。反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，66 ℃ 30 s，72 ℃ 4 min，35个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物用1.2%的琼脂糖进行电泳检测，产物回收使用SanPrep柱式DNA胶回试剂盒(上海生工)，序列测序由上海生工完成。

1.2.4 序列分析及系统进化树的构建通过Geneious 4.8.2软件对测序结果进行序列拼接，将cDNA序列及其编码的蛋白序列与NCBI数据库中的其它物种同源序列进行BLAST比对分析。蛋白序列比对使用DNAMAN 6.0软件；系统发育树的构建使用MEGA 5.2软件的最小进化法，并进行Bootstrap检测(抽样次数为1 000)。

1.2.5 基因表达分析逆转录使用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒(RR047，宝生物公司)，PCR使用SYBR Premix Ex Taq II试剂盒(RR820A，宝生物公司)。18S rRNA引物为F：CGGCTACCACATCCAAGGAA，R：TGTCACTACCTCCC-CGTGTCA；AktrPHYA1引物为F：TTGGAAGGATTATGAGATGGA，R：AGTGAATGACAGACGAGTT。Real-time PCR使用Eppendorf Realplex2进行，结果采用2-Δ(ΔCt)方法进行分析。

2　结果与分析

2.1 三叶木通PHYA1基因cDNA扩增

通过RT-PCR方法获得了片段长度为3 496 bp的cDNA序列(图1),包括3 426 bp的完整开放阅读框(ORF)，编码1 141个氨基酸(图2)。该片段与拟南芥(Arabidopsisthaliana)、荷花(Nelumbonucifera)、葡萄(Vitisvinifera)、马铃薯(Solanumtuberosum)、龙眼(Dimocarpuslongan)、耧斗菜(Aquilegiaformosa)等物种中的PHYA基因序列相似性为73%～99%；其编码的氨基酸序列与荷花、耧斗菜、葡萄、龙眼、辣根(Armoraciarusticana)、百脉根(Lotusjaponicas)、拟南芥等的PHYA蛋白的序列相似性为75%～83%，由此可见获得的该序列为三叶木通的PHYA基因，命名为AktrPHYA1，GenBank登录号为kp864055。

图 1　三叶木通PHYA1基因RT-PCR扩增电泳图Fig. 1　Agarose gel electrophoresis of AktrPHYA1 cDNA by RT-PCR

2.2 氨基酸序列比对及结构分析

通过NCBI数据库进行蛋白质结构预测分析，AktrPHYA1氨基序列包括一个GAF结构域(氨基酸位置为Ser219-Leu402)、一个PHY结构域(Val413-Asp589)、两个PAS结构域(Arg629-Met735和Leu762-Gln873)、一个组氨酸激酶A结构域(His Kinase A Domain)(Leu900-Asp950)和一个类似组氨酸激酶ATP激酶结构域(Histidine kinase-like ATPase)(Leu1012-Val1115)(图3)。与NCBI数据库序列进行比对，AktrPHYA1氨基酸序列与拟南芥、荷花、可可树(Theobromacacao)、马铃薯、龙眼、耧斗菜、大叶杨(Populustrichocarpa)、百脉根的同源蛋白具有77%～83%的序列一致性(图4)。

2.3 PHYA蛋白系统发育分析

利用AktrPHYA1氨基酸序列与其它物种PHYA同源蛋白建立系统发育树，可见单子叶植物与双子叶植物的光敏色素A分别聚为两类(图5)。在双子叶植物中，AktrPHYA1与耧斗菜、荷花的PHYA聚为一支，同源性较高(序列一致性分别为83%和82%)；其它物种聚为一支。在单子叶禾本科植物中，高粱(Sorghumbicolor)、玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)与小麦(Tritiumaestivum)的PHYAs聚为一支(图5)。

2.4 三叶木通PHYA1的表达分析

以18S rRNA为内参基因，对三叶木通PHYA1在不同组织的表达进行检测。三叶木通PHYA1在种子、叶片、茎、雄花和雌花中均有表达。其在叶片中表达最弱，在种子中表达水平最高，为叶片中的280倍，在茎、雄花和雌花中的表达水平分别是叶片中的4.7倍、23倍和5.8倍(图6)。

3　讨论

通过RT-PCR首次从三叶木通中获得了编码光敏色素A的cDNA序列,AktrPHYA1结构N-端包括一个GAF结构域和一个PHY结构域，GAF结构域在各种光转化蛋白之间相对保守，突变研究表明GAF结构域对植物感受光信号起着非常重要的作用(Su et al, 2007)，它与PHY结构域共同承担结合发色团、光吸收以及光诱导的可逆性转化的功能(Clough et al, 1999)；PHY结构域非常保守，对调节光激素的活性和Pfr构型的稳定性十分重要(Rockwell et al, 2006)。C-端包括两个PAS结构域、一个组氨酸激酶A结构域和一个类似组氨酸激酶的ATP激酶结构，光敏色素为细胞质蛋白，主要定位于细胞核外，光敏色素入核过程是其调节光信号的关键步骤， PAS结构域对于PHYA进入到细胞核中起重要作用(Gu et al, 2000)。

图 2　三叶木通PHYA1的cDNA序列及推导的氨基酸序列Fig. 2　Sequence of AktrPHYA1 cDNA and the deduced protein sequence

图 4　三叶木通PHYA1与其它植物PHYA蛋白的多序列比对　序列来源： ACV87353.1(耧斗菜)，XP_010247866.1(荷花)，XP_002278610.1(葡萄)。 Fig. 4　Multiple alignment of AktrPHYA1 with PHYAs from other species　Sequences are as follows: ACV87353.1 (Aquileqia formosa), XP_010247866.1 (Nelumbo nucifera), XP_002278610.1 (Vitis vinifera).

图 5　三叶木通PHYA1与其它物种PHYA同源蛋白的系统发育树Fig. 5　Phylogenetic tree constructed with AktrPHYA1 and homologs from other species

图 6　三叶木通PHYA1在不同组织中的表达Fig. 6　Expression levels of AktrPHYA1 in different tissues

三叶木通PHYA1氨基酸序列与耧斗菜、荷花的光敏色素A比对显示,这些结构域中都具有明显相对保守的氨基酸序列，说明光敏色素A作为植物最初的光受体，在三叶木通中存在的PHYA1可能具有与耧斗菜、荷花光敏色素A类似的光信号传导功能。在AktrPHYA1与其它物种的光敏色素A同源蛋白系统树中，双子叶植物与单子叶植物各聚为一支，这可能是双子叶植物与单子叶植物长期不同进化方向造成的差异。通过比较被子植物和裸子植物的光敏色素基因发现，随着开花植物的进化，PHYA基因家族的复杂程度和规模均有所增加(Alba et al,2000)。PHYA家族的复杂程度和规模在不同开花植物中明显不同，同一光敏色素分子的不同区段间进化速率也不尽相同(Mathews & Sharrock,1996)。C-端进化速率是N-端的2倍(Alba et al,2000)。双子叶植物中同属木兰亚纲多心皮类植物的三叶木通、耧斗菜和荷花聚为一支，分类地位独特，与植物形态建立的系统结果一致。

Real-time PCR对三叶木通PHYA1在不同组织中的表达分析表明，AktrPHYA1在茎、叶、雄花、雌花和种子中均有表达但表达水平有明显差异，说明AktrPHYA1的表达积累量具有组织特异性。种胚中的光敏色素是种子成熟过程中和种子吸水后几小时内合成的(杨期和等, 2003)，是植物光形态建成的受体。一些植物种子萌发受到PHYA的调控(Heschel et al, 2008 ；Miguel & Sánchez, 1992)，PHYA吸收远红光，可通过提高种胚的生长能力、降低渗透势和增加细胞壁的伸长性来促进种子的萌发(Miguel & Sánchez, 1992；Simonovic et al, 2000)。AktrPHYA1在种子中表达最强，说明其对于三叶木通种子发育可能起着非常关键的作用。过量表达烟草PHYA基因的烟草叶面积明显增大(Robson et al, 1996)，在叶部特异表达拟南芥PHYA基因的转基因水稻穗变大，产量增加(Kong et al, 2004；Ajay et al, 2006)。将拟南芥PHYA转入地被菊，结果发现露天栽培条件下，转基因株系花期明显提前，株型则明显矮化(惠婕等, 2011)。AktrPHYA1在叶片、茎、雄花、雌花中都有表达，说明AktrPHYA1还可能参与植物的叶片发育、茎的伸长和开花调控过程。

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Sequence and expression analysis of phytochrome A fromAkebiatrifoliata

LI Hui-Li1,2, HAN Xing-Jie2, LIAO Liang2, XU Ling-Ling2*

( 1.CollegeofLandscapeandArt,JiangxiAgriculturalUniversity, Nanchang 330045, China;2.SchoolofPharmacyandLifeSciences,JiujiangUniversity, Jiujiang 33200, China )

Phytochrome (PHY) is one of the most important light receptors in plants. It is involved in many physiological processes such as the regulation of seed germination, seedling growth, stem elongation, cotyledon extension, and flowering control. In this study, a cDNA encoding PHYA was firstly amplified fromAkebiatrifoliataby using the RT-PCR technique (designated asAktrPHYA1, GenBank accession number: KP864055), which consists of 3 496 bp, with a 3 426-bp open reading frame (ORF) encoding a 1 141-amino-acid protein. The N-terminal of AktrPHYA1 is dedicates for light acceptation and contains a GAF domain and a phytochrome domain. The C-terminal is a light-regulated region, and is comprised of two PAS domains, a His Kinase A domain and a Histidine kinase-like ATPase domain. The homology protein alignment showed that theAktrPHYA1 shared 83% and 82% identities with thePHYAs fromNelumbonuciferaandAquileqiaformosa, respectively. Phylogenetic tree analysis indicated that monocots and dicots gathered into two branches. In the dicots,Akebiatrifoliate,NelumbonuciferaandAquileqiaformosaclustered together, indicating they are closely genetically related. Expression analysis indicated thatAktrPHYA1 was detected in all tissues under investigation, including leaves, stems, male and female flowers and seeds. It was the most strongly expressed in seeds, whereas the most weakly in leaves. The expression pattern implied the likely roles ofAktrPHYA1 inAkebiatrifoliata. This work will provide information for further research of its functions in plants.

Akebiatrifoliata, phytochrome A, sequence analysis, expression analysis

10.11931/guihaia.gxzw201503003

2015-03-03

2015-06-11

国家自然科学基金(31460073)；江西省科技计划项目(20142BBF60055，20143ACF60010)[Supported by the National Natural Science Foundation of China (31460073)； Scientific and Technological Planning Project of Jiangxi Province (20142BBF60055，20143ACF60010)]。

李慧丽(1986-)，女，山西长治人，硕士研究生，主要研究方向为植物分子生物学，(E-mail) 462053080@qq.com。

徐玲玲，女，硕士，教授，研究方向为植物分子生物学，(E-mail) 13907021710@163.com。

Q949

A

1000-3142(2016)09-1061-07

李慧丽， 韩兴杰， 廖亮， 等. 三叶木通光敏色素A基因的序列及表达分析 [J]. 广西植物， 2016， 36(9):1061-1067

LI HL, HAN XJ, LIAO L，et al. Sequence and expression analysis of phytochrome A fromAkebiatrifoliata[J]. Guihaia，2016， 36(9):1061-1067