油橄榄授粉受精和胚胎发育过程观察

姜成英， 史艳虎， 吴文俊， 朱振家

( 1. 甘肃省林业科学研究院/甘肃省油橄榄工程技术研究中心， 兰州 730030; 2. 甘肃农业大学 资源与环境学院， 兰州 730070 )



油橄榄授粉受精和胚胎发育过程观察

姜成英1， 史艳虎1， 吴文俊1， 朱振家2

( 1. 甘肃省林业科学研究院/甘肃省油橄榄工程技术研究中心， 兰州 730030; 2. 甘肃农业大学 资源与环境学院， 兰州 730070 )

该研究以油橄榄“鄂植-8”为材料，应用压片荧光观察花粉在柱头和花柱中的萌发及生长情况，采用石蜡制片法观察油橄榄的胚珠结构特点和授粉受精过程。结果表明：油橄榄为1子房2心室4胚珠，珠心较发达，由多层细胞构成，属于厚珠心椭圆型胚珠，胚珠直生；花开时花粉粒落到柱头上立刻萌发，随后花粉管在花粉通道中生长，再后进入子房经子房内表面，大部分花粉管不能到达胚珠，仅少数沿胎座生长经珠柄进入珠孔，释放2个精子，2个精核分别进入卵细胞和极核，并与卵核及极核相互融合；观察到合子中雌、雄性核仁融合的过程。授粉受精各阶段经历的时间为花粉落到柱头上立刻萌发; 授粉后6 d左右，花粉管长入胚珠的珠孔，随后释放精子; 10 d左右完成授粉受精，30 d左右形成心型胚，40 d左右胚发育几乎成熟。在进行子房石蜡切片中，共观察到612个完整子房切片，发育完整的子房为97.53%，完成授粉受精的胚珠为15.52%。油橄榄在自然授粉下，约85%的胚珠授粉受精过程不能完成，在一定程度上影响其坐果。 该研究结果为油橄榄授粉受精、高效生产等提供了理论依据。

油橄榄， 授粉， 受精， 时间， 胚胎发育

油橄榄(Oleaeuropaea)为木犀科(Oleaceae)木犀榄属(Olea)的常绿小乔木，是一种高产、耐旱、耐高温的木本油料树种，原产于西亚(0°～30° E，30°～45° N)和地中海(26°～72°E，21°～43° N)区域(Faisal et al, 2012)。我国于1964年开始引进油橄榄，以甘肃省武都为中心的白龙江低山河谷区，目前已成为中国最大的油橄榄种植基地之一，截止2013年底，种植面积达2.2万hm2(张正武，2014)。目前该区大部分油橄榄树龄已度过童期，进入盛果期，但和原产地同龄树相比，存在坐果率低等严重问题(Saleh et al，2006)。

油橄榄坐果率与其授粉受精过程密不可分，其生殖生物学方面已展开了研究。Cuevas & Polito(2004)描述了油橄榄主要是异花授粉，且是风媒传粉，但也存在少量虫媒传粉；Choi et al(2010)对油橄榄花粉活力进行了研究；彭建国等(2006)发现不同品种油橄榄相互授粉时因花粉亲和力不同而坐果率有明显差异；Elizabeth et al(2012)发现油橄榄会发生授粉不亲和的现象；Connor & Fereres(2005)研究了油橄榄胚囊形成过程；Qian et al(2009)研究了雌雄配子的形成；Cevriye et al(2013)、Boussadia(2010)和Shevchenko(2001)研究了胚乳的发育过程；Martins et al(2006)研究了一些异常发育的花，特别是部分发育不完整雌蕊的形成。而关于油橄榄授粉受精过程的观察研究较少。本研究以甘肃陇南地区主栽品种“鄂植-8”(O.europaea“EZhi-8”)为材料，研究了授粉受精过程及时间，为我国油橄榄的生殖生物学研究积累基础知识资料，同时为油橄榄授粉受精和高效生产等提供理论依据。

1　材料与方法

1.1 材料

油橄榄“鄂植-8”品种，树高约4.5 m，树龄15 a，果较大，产量高，丰产稳产性能好，授粉类型为自然授粉，是甘肃省审定的良种。材料均采集于甘肃省武都区大湾沟油橄榄科技示范园(104°53′ E，33°24′ N)。该园海拔1 079 m，年均气温14.9 ℃，年均相对湿度61%，最冷月(1月)平均气温4.1 ℃，年均降水105 d，年均降水量483 mm，集中在6-8月(约占全年的50%)，年日照时数1 923 h，无霜期在280 d以上，属亚热带湿润气候。试验园环境因素良好，水肥管理和立地条件基本一致，以消除环境因素对试验的影响。

1.2 方法

2013年5月8日至6月18日连续固定开花后授粉的雌蕊。田间平均气温为15～23 ℃，当油橄榄花瓣完全打开成180°，柱头分泌粘液，花药开裂，即为开花，此时已授粉。开花后于1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、96 h、5 d、6 d、7 d、8 d、15 d、20 d、25 d、30 d、40 d各采集100朵。材料经卡诺固定液(无水乙醇∶冰醋酸=3∶1)固定2 h，转至FAA中，于4 ℃冰箱保存(杨虹等，2009)。对授粉后1～144 h 的花柱，以8 mol·L-1NaOH软化约4 h 后，蒸馏水冲洗干净，用0. 05% 水溶性苯胺蓝溶液染色4～5 h后，常规压片，观察花粉在柱头和花柱中的萌发生长情况(廖婷，2014)；常规石蜡制片法制片，以番红及爱氏苏木精整体染色，切片厚度为10 μm。用Olympus正置万能摄像生物荧光显微镜下观察并拍照。

2　结果与分析

2.1 油橄榄胚珠的结构特点

经石蜡切片观察，发现油橄榄自小花原基一群细胞发育后，基部逐渐膨大，最后形成子房 (图版Ⅰ:A)，其特征为1子房2心室4胚珠(图版Ⅰ:B)，顶端的柱头成v字型，花柱为连接柱头和子房的部分(图版Ⅰ:A)；在雌蕊发育过程中，子房内胎座表皮中间的部分细胞进行平周分裂，产生一团分生组织， 即胚珠原基 (图版Ⅰ:C)。当胚珠组织生长时，两层珠被开始自基部产生细胞分裂。外珠被首先开始产生分裂，接着孢原细胞平周分裂，产生珠心，随后内珠被开始形成， 其最内一层细胞往往转化为栅栏组织，具有向内输送营养的功能，生长较快外珠被细胞开始包围珠心细胞，随着外珠被的继续分裂及生长，珠心顶端出现珠孔(图版Ⅰ:D)。油橄榄的珠心较发达，由多层细胞构成，属于厚珠心椭球型胚珠，胚珠直生(图版Ⅰ:D)。花柱为圆柱状，且为空心；花柱两侧区域存在细胞群组成的花粉管通道(图版Ⅰ:E)，细胞间隙较大，排列松散。

图版 Ⅰ　油橄榄子房结构图　OV. 胚珠； OW. 子房壁； STY. 花柱； AN. 花药，STI. 柱头； OI. 外珠被；II. 内珠被； AC. 孢原细胞； MI. 珠孔； PT. 花粉管； MC. 乳突细胞。 A. 雌蕊及子房的结构 (×40)； B. 子房的横切面 (×100)； C. 孢原细胞 (箭头) (×400)； D. 胚珠的结构 (×200)； E. 花柱的横切 (箭头指向花粉管通道)(×200)。Plate Ⅰ　Ovary structure of Olea europaea　OV. Ovule； OW. Ovary wall； STY. Style； AN. Anther， STI. Stigma； OI. Outer integument； II. Inter integument； AC. Archesportial cell； MI. Micropyle； PT. Pollen tube； MC. Mastoid cell. A. Pistils and ovary of structure (×40); B. Cross-section of the ovary (×100); C. Archesporial cell (shown by arrow) (×400); D. The ovule of structure (×400); E. Style crosscutting, the pollen tube channel (shown by arrow) (×200).

图版 Ⅱ　油橄榄授粉过程　A. 柱头及花粉粒 (×200)； B. 花粉管(箭头)在花柱中生长 (×400)； C. 授粉后1 h，大量花粉在柱头上萌发生长 (×200); D. 授粉后24 h，花粉管(箭头)在花柱中生长 (×200); E. 授粉后48 h，花粉管(箭头)到达花柱1/3 位置 (×200); F. G. 授粉后72 h，花粉管(箭头)到达花柱2/3 位置 (×200); H. 花粉管(箭头)在引导组织中生长 (×40); I. 授粉后96 h，花粉管(箭头)进入胚珠 (×100); J. 授粉后144 h，花粉管(箭头)到达珠孔 (×100)。Plate Ⅱ　Pollination process of Olea europaea　A. Stigma and pollen grains (×200); B. Pollen tube (shown by arrow) growth in the style (×400); C. Many of pollens germination on the stigma after pollination 1 h (×200); D. Pollen tube (shown by arrow) grows in the pollen channel after pollination 24 h (×200); E. Pollen tube (shown by arrow) grows to about 1/3 of the style after pollination 48 h (×200); F，G. Pollen tube (shown by arrow) grows to about 2/3 of the style after pollination 72 h (×200); H. Pollen tube (shown by arrow) passes through the transmitting tissue (×40); I. Pollen tube (shown by arrow) enters into the ovule after pollination 96 h(×100); J. Pollen tube (shown by arrow) enters into the micropyle after pollination 144 h (×100).

图版 Ⅲ　雌雄配子的结合　A. 一精子(黑色箭头)靠近卵细胞 (白色箭头) (×400)； B. 精子(黑色箭头)开始进入卵细胞(白色箭头) (×400)； C. 精子在卵细胞里 (×400)； D. 雌雄核融合形成一个大核 (×400)； E. 一精子(黑色箭头)靠近两极核(窄箭头) (×400)； F. 精子(黑色箭头)与两极核(窄箭头)融合 (×400)； G. 三核融合 (×400)； H.初生胚乳核内一个大核仁 (×400)； I. 分化的胚 (×40)； J. 几乎成熟的胚 (×40)。Plate Ⅲ　Combined male and female gametes　A. A sperm (shown by black arrow) close to the egg (shown by white arrow) (×400); B. A sperm (shown by black arrow) entered the egg (shown by white arrow) (×400); C. Sperm inside the egg cell (×400); D. Male and female nuclei fuse to form a big nucleolus (×400); E. A sperm nucleus (shown by black arrow) near the two-polar nucleus (shown by narrow arrow) (×400); F. Fusion of a sperm (shown by black arrow) and two-polar nuclei (shown by narrow arrow) (×400); G. Fusion of three nuclear (×400); H. A big nucleolus in primary endosperm nucleus (×400); I. Embryo is differentiation (×40); J. Almost mature embryos (×40).

2.2 花粉在柱头上萌发及花粉管的生长

成熟花粉为橄榄球型；柱头表面具发达的乳突细胞(图版Ⅱ:A)，以便粘住花粉；花药开裂后，散出大量花粉且随风飘落到柱头上，花粉释放出亲脂性物质与柱头上的亲脂性物质相互接触，并从柱头表面的乳突细胞中吸收水分，随后花粉管自萌发孔长出，经花粉管通道后，向子房方向延伸(图版Ⅱ:B)。

经水溶性苯胺蓝染色后，能正常萌发的花粉管呈现强烈的蓝色荧光反应。授粉后1 h，大量花粉开始在柱头上萌发，从萌发孔中长出的花粉管朝中空花粉通道生长(图版Ⅱ:C) ; 授粉后24 h，部分花粉管到达花柱上部位置(图版Ⅱ:D) ; 授粉后48 h，部分花粉管到达花柱1 /3位置(图版Ⅱ:E) ;授粉后72 h，花粉管到达花柱2 /3 位置(图版Ⅱ:F、G) ; 授粉后96 h，少量花粉管到达花柱基部并沿引导组织生长(图版Ⅱ:H)，随后进入胚珠(图版Ⅱ:I)；授粉后144 h，萌发的花粉管经花柱进入子房，经珠孔进入胚囊中(图版Ⅱ:J)。

2.3 受精过程

开花后6 d左右的切片中发现一个精子靠近卵细胞 (图版Ⅲ:A)，彼此相互靠近的精核核膜与卵细胞的核膜开始融合(图版Ⅲ:B)，紧接着精核更靠近卵核，进而出现雌雄性核仁(图版Ⅲ:C)，随后精核开始破裂，其染色质逐渐分散于卵细胞里，此时精卵相互融合形成合子。合子要经过约2 d的整修期，其间最主要的变化特征为合子内的核仁体积逐渐增大(图版Ⅲ:D)。授粉后约8 d，合子仍以1个大核仁为主。

开花后6 d左右为精核与次生核的融合期。一个精核靠近次生核(图版Ⅲ:E)。精核进入极核融合后先出现三核仁(图版Ⅲ:F)，形成的三核仁不断相互融合形成初生胚乳核的两核仁(图版Ⅲ:G)。刚形成的两初生核又相互不断融合，初生胚乳核中其核仁相互融合的同时、体积逐渐增大，接着初生胚乳核移向胚囊中部，很快二核仁融合为一个大核仁(图版Ⅲ:H)。胚形成后，胚柄开始退化，胚的表皮细胞吸收胚乳的营养物质而使胚继续发育(图版Ⅲ:I)；油橄榄几乎成熟的胚，呈橄榄球型 (图版Ⅲ:J)。

2.4 授粉受精全历程

对612枚雌蕊组织制片，并对约2 400个胚珠的观察表明，油橄榄在田间平均气温约20 ℃的条件下，花开后花粉粒落到柱头上立刻萌发，花粉管穿过花粉管通道进入子房，经胎座表面长进珠孔，继而花粉管释放两精子，1精子与卵细胞相互融合，同期另一精核与两极核相互融合，合子休眠一段时间，此后合子开始分裂。30 d左右胚核发育成心型，40 d左右，胚分化形状如橄榄球型，此时接近发育成熟。

由表1可知，子房发育过程基本完整，有卵细胞和极核的子房在95%以上，但授粉受精的胚珠仅为15.52%，在30 d左右观察到92.35%的胚发育正常，40 d左右观察到所有胚接近成熟。

3　讨论与结论

油橄榄的授粉受精过程与大多被子植物的双受精过程基本一致，经历精卵的相互融合及精核与两极核相互融合。经历的过程为花粉管通过花柱中的通道，进入子房，直达胚珠，进而穿过珠孔，伸向胚囊。进入胚囊释放精细胞是在授粉后6 d左右，可能与其本身的雌蕊组织结构有关，也可能与植物类别有关。花粉粒萌发和花粉管生长速度与植物种类的关系较密切，因而从授粉到受精的时间相差较大。植物的受精时间各不相同，如七叶树(Aesculuschinensis)授粉受精时间为1～4 d(李莺等，2012)，苹果(MaluspumilaMill)由授粉到受精的时间为5 d，连翘(Forsythiasuspensa)的授精时间约18 d，栎属(QuercusL.)植物则需长达一年或一年多；而一般农作物的花粉萌发较快，如棉(Gossypiumhirsutum)需15～32 h，而水稻(Oryzasativa)只需1.5 h，小麦(Triticumaestivum)仅需1 h，这些差异主要由遗传性所决定(刘红霞，2010)。油橄榄从传粉到受精的时间较长，约为10 d。

表 1　油橄榄子房切片观察结果

本研究发现，有两极核和卵细胞的胚珠比率较高(95.63%)，但成熟的八细胞胚囊几乎观察不到，其原因可能是反足细胞存在的时间较短、退化得较早，也可能是八细胞不在一个平面上，较难观察到，其原因需进一步研究；本研究还发现授精的胚珠很低(15.52%)，其原因可能是其余3个配囊发育较迟缓或退化，此结果与Petka et al(2011)研究结论基本一致。

本研究中，子房的发育过程基本完整，有卵细胞及极核的子房在95%以上，但授粉受精的胚珠只有15.52%，这表明卵细胞与精子及极核与精子结合过程中受阻。果树授粉受精不良的原因各不相同，如用荧光显微镜观察无核世纪梨(CenturySeedless)的自花授粉花粉管不能进入胚囊(朱玉玲等，2013)；荔枝(Litchichinensis)中的妃子笑与南岛无核胚胎发育过程中存在胚胎发育败育现象(冯蔚等，2010)；苹果树授粉不亲和，是因为他们含有完全相同的S基因型，导致受精过程不能完成(张晓明等，2005)；桂花(Osmanthusfragrans)的胚、胚乳发育过程中存在大量败育现象，这是桂花座果率低的一个重要原因(杨琴军等，2003)。开花后30 d左右是油橄榄的生理落果期，此时期出现大量落果，且授粉受精的胚珠为15.52%，说明授粉受精不良，在一定程度上会影响其坐果。

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Observation on pollination, fertilization and embryo development process inOleaeuropaea

JIANG Cheng-Ying1， SHI Yan-Hu1， WU Wen-Jun1， ZHU Zhen-Jia2

( 1.GansuAcademyofForestry/OliveEngineeringTechnologyResearchCenterofGansuProvince, Lanzhou 730030, China;2.CollegeofResourceandEnvironmentalSciences,GansuAgricultureUniversity, Lanzhou 730070, China )

The present research was undertaken to better understand the reason of the low fruit setting and gather the basic knowledge of reproductive biology ofOleaeuropaea, the structural characteristics of ovules, pollination and fertilization process of ovules to master the various stages of time and the completed percentage of ovary pollination and fertilization. Fluorescence microscopy was used to observe pollen tube growth, and the paraffin slice technique was used to observe the ovary pollination and fertilization in olive of ‘EZhi-8’. The results showed that the ‘EZhi-8’ is one ovary two ovules four ventricles with developed nucellus, orthotropous and crassinucellate ovule. Pollen grains germinated immediately when they were fallen on stigma, then pollen tubes grew in the transmitting tissue of style, entering ovary and growing on the surface of endocuticle of ovary wall, and passing micropore through placenta and funicle. Pollen tube was released two sperms, one entered egg and another in the secondary nucleus, which was a fusion process of male and female. The performance time of pollination and fertilization was as follows: pollen grains germinated very soon on stigma, and the pollen tube grew into the ovule micropyle and released sperm for 60 d after flowering. After flowering, within 10 d fertilization was finished , 30 d developed omphalos-embryo and within 40 d maturation occurred. A tatol of 612 ovary slices were observed by treating with a series of paraffin treatments, the highly developed ovaries of ‘EZhi-8’ accounted for 97.53%, the finishment of pollination and fertilization process of ovules accounted for 15.52%. Our results showed that there were about 85% of ovules were not fertilized in the natural conditions, which affected the fruit setting to a certain extent.

Oleaeuropaea, pollination, fertilization, time, embryonic development

10.11931/guihaia.gxzw201504018

2015-04-09

2016-01-27

国家自然科学基金 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31160170)]。

姜成英(1973-)，女, 甘肃陇南人, 研究员, 主要从事经济林方面的研究, (E-mail)253464579@qq.com。

文献标识码： A文章编号： 1000-3142(2016)09-1026-06

姜成英， 史艳虎， 吴文俊， 等. 油橄榄授粉受精和胚胎发育过程观察 [J]. 广西植物， 2016， 36(9):1026-1031

JIANG CY， SHI YH， WU WJ， et al. Observation on pollination, fertilization and embryo development process inOleaeuropaea[J]. Guihaia， 2016， 36(9):1026-1031