降钙素对兔膝骨性关节炎关节软骨的保护作用及机制

尤笑迎　杨红梅

(郑州人民医院骨科,河南　郑州　450003)



降钙素对兔膝骨性关节炎关节软骨的保护作用及机制

尤笑迎杨红梅1

(郑州人民医院骨科,河南郑州450003)

目的探讨降钙素(CT)对膝骨性关节炎(KOA)关节软骨的保护作用及机制。方法36只健康大耳白兔随机分为假手术组(sham组)、CT治疗组(CT组)和生理盐水处理组(NS组),CT组和NS组采用改良Hulth法制备KOA模型，sham组以同样术式进入关节腔但不做其他处理。术后第6周开始CT组每天皮下注射CT 5 U/kg，sham组和NS组给与等量生理盐水皮下注射，连续4 w。观察KOA发病过程软骨形态变化、酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清和关节液白细胞介素(IL)-1β、免疫组化法检测关节软骨Ⅱ型胶原和基质金属蛋白酶(MMP)-1的变化、TUNEL法检测软骨细胞凋亡情况。结果NS组关节软骨损伤严重，Mankin评分明显高于sham组，血清及关节液IL-1β含量明显升高(P<0.05)，关节软骨Ⅱ型胶原含量明显降低，MMP-1活性和软骨细胞凋亡百分数明显升高(P<0.05)；而CT治疗组关节软骨损伤较NS组减轻、IL-1含量、MMP-1活性和软骨细胞凋亡百分数明显降低(P<0.05)，Ⅱ型胶原含量明显升高。结论CT可能通过抑制IL-1β分泌，恢复软骨基质的合成与降解平衡，减少软骨细胞凋亡，对关节软骨具有一定的保护作用，从而延缓关节软骨退变过程。

膝骨性关节炎；白细胞介素-1；降钙素；细胞凋亡

骨性关节炎(OA)是临床常见的退行性关节疾病,多发生于负重大、活动多的关节,以膝关节最常受累。 据世界卫生组织的调查〔1〕，OA发病人口已达10%左右，其发病率和年龄呈现正相关，年龄≥60岁时发病率50%左右，而≥75岁发病率可达80%，是导致中老年患者关节疼痛和致残的首要原因〔2〕,目前认为OA 的发生发展是多因素参与的复杂过程，包括遗传倾向、年龄、炎性细胞因子、自由基、性激素、创伤、软骨细胞过度凋亡等，其中炎性细胞因子特别是白细胞介素(IL)-1β〔3〕和软骨细胞过度凋亡〔4〕与老年 OA的关系密切。OA缺乏早期有效的治疗手段，给家庭和社会带来了严重负担，因此，目前迫切需求明确OA 的发病机制，从而有效预防和降低OA 的发生。研究发现，降钙素(CT)可通过与破骨细胞表面的CT受体结合抑制骨吸收，同时还可直接作用于软骨细胞促进骨小梁组织及骨基质成分合成，而延缓OA的病理进程〔5,6〕。本研究旨在观察CT对兔膝骨性关节炎(KOA)模型关节软骨的保护作用，同时检测OA发生过程中IL-1β的表达及软骨细胞的凋亡情况，探讨其可能的作用机制。

1　材料和方法

1.1材料36只大耳白兔(普通级，购自河南省实验动物中心)，4～6月龄，体质量2.5～3.0 kg，雌雄不限。鲑鱼CT注射液为北京诺华制药有限公司产品。Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶(MMP)-1免疫组化试剂盒，酶联免疫吸附(ELISA)及TUNEL检测试剂盒分别购自武汉博士德生物制剂有限公司和上海锐聪科技发展有限公司。

1.2方法

1.2.1动物分组36只大耳白兔适应性喂养1 w后,随机分为假手术组(sham组)、CT治疗组(CT组)和生理盐水处理组(NS组)，每组12只。CT组和NS组采用改良Hulth法〔7〕制备KOA模型，sham组以同样术式切开关节腔但不做其他处理。

1.2.2术后处理术后分笼饲养，每日肌肉注射青霉素20 万U，连续1 w以预防感染。1 w后每天强迫活动1 h，连续4 w。术后第6周CT组行降钙素5 U/kg每天皮下注射，连续4 w，sham组和NS组给予等量生理盐水皮下注射。

1.2.3标本采集及处理9 w后经耳缘静脉空气栓塞处死动物，1 ml生理盐水冲洗关节腔，收集关节液；同时心脏取血5 ml，37.0℃水浴45 min。关节液及血样本3 000 r/min离心30 min，取上清液，-20℃保存，待检。

1.2.4IL-1β含量检测采用ELISA双抗夹心法检测血清、关节滑液中的IL-1β含量，按试剂盒说明书进行，酶标仪L450 nm处测OD值。

1.2.5关节软骨病理变化观察实验结束打开关节腔，观察术侧膝关节关节囊、滑膜、关节软骨及关节液情况，同时取股骨内髁关节软骨，固定、脱钙、包埋、切片，用于HE和免疫组织化学染色。软骨组织形态变化参照Mankin改良的关节软骨病理评分标准〔8〕进行积分统计。

1.2.6软骨组织Ⅱ型胶原、MMP-1蛋白表达情况检测Ⅱ型胶原、MMP-1蛋白检测采用免疫组织化学染色法进行，按试剂盒说明书进行，HPIAS-1000高清晰彩色病理图像分析系统(同济千屏)测定阳性细胞的灰度值，取每张切片均值作为测量值。

1.2.7软骨细胞凋亡情况检测采用TUNEL法检测软骨细胞的凋亡情况，按试剂盒说明书进行。每张切片随机选取5个不重叠高倍视野，计算阳性细胞百分数。

2　结　果

2.1大体观察术后3～5 d膝关节肿胀较明显，后肢力量减低，活动减少，1 w后逐渐好转，sham组可自由活动，CT和NS组动物膝关节不稳，有异常活动，9 w内膝关节感染2只，被淘汰，列入观察的共34只，sham组11只，NS组11只，CT组12只。sham组滑膜无明显增生，关节液清亮透明，关节面平整光滑，呈蓝白色；NS组滑膜出现不同程度的增生粘连，关节液混浊呈泡沫状，关节面粗糙，呈灰黄色；CT组可见滑膜轻度增生，关节液略增多，关节面色泽变淡，光泽度降低。见图1。

2.2软骨组织形态学观察正常关节软骨分为表浅层、移行层、放射层和钙化层。sham组关节软骨面平滑规整，软骨细胞多，排列整齐，基质均匀、粉红色，软骨细胞核呈深蓝色，软骨层次及潮线清晰可辨；NS组软骨表层变薄，出现裂隙，有软骨细胞簇集现象，潮线多不完整或消失；CT组软骨表面较规则、裂隙少，软骨结构可辨，潮线尚完整，见图2，Mankin评分见表1。

图1　各组动物左下肢的大体形态观察

图2　各组关节软骨形态学观察结果(HE，×200)

2.3血清及关节液IL-1β含量sham组血清及关节液IL-1β吸光度值明显低于NS和CT组，而NS组又明显高于CT组(P<0.05)，见表1。

2.4软骨组织Ⅱ型胶原、MMP-1蛋白表达情况sham组软骨基质Ⅱ型胶原主要分布于表层和中层，均匀深染，吸光度值高于NS和CT组；NS组Ⅱ型胶原染色淡，表层有脱色现象；CT组软骨基质Ⅱ型胶原染色良好，主要分布于表层及中层，细胞簇周围出现深染，吸光度值高于NS组(P<0.05)，见表1 。NS组软骨全层可见呈棕黄色表达的MMP-1，sham组仅表层软骨细胞内偶见MMP-1弱阳性表达，CT组阳性表达介于前二者之间。

表1　各组关节软骨Mankin评分及Ⅱ型胶原、MMP-1及IL-1吸光值变化

与sham组比较:1)P<0.05；与NS组比较:2)P<0.05

2.5软骨细胞凋亡情况见图3。NS组软骨全层可见大量凋亡的软骨细胞，细胞凋亡细胞百分数为(29.65±2.03)%，sham组偶见凋亡的软骨细胞，细胞凋亡细胞百分数为(4.12±0.37)%，CT组软骨细胞凋亡情况(8.32±1.62)%介于前两者之间，组间比较差异显著(P<0.05)。

图3　各组关节软骨细胞凋亡情况(TUNEL法，×200)

3　讨　论

OA以软骨进行性退变、软骨下骨变性、骨赘形成及滑膜炎性改变为主要病理特征〔9〕,其发生机制尚未完全阐明，目前研究认为炎性细胞因子特别是IL-1β和细胞凋亡在OA的病理过程中发挥重要作用〔3,4,10〕。IL-1是炎症反应的始动因素和重要调节因子,由巨噬细胞、软骨细胞和滑膜细胞产生,有IL-1α和IL-1β两种亚型，膝关节液中以IL-1β为主,正常情况下滑膜细胞产生微量的IL-1β，KOA时滑膜组织和软骨细胞可通过自分泌作用合成大量的IL-lβ，IL-1β反过来又可刺激滑膜增生和破坏软骨组织，形成恶性循环，IL-1β量与OA严重程度呈正相关〔11〕。软骨细胞膜上分布有IL-1β 的受体，高水平的IL-1β与其受体结合干扰软骨细胞的正常代谢和功能，一方面促进MMP-1和MMP-3表达，加快软骨基质的降解〔12,13〕； 另一方面IL-1β还可通过两种方式参与软骨细胞凋亡:一是刺激软骨细胞和滑膜分泌iN0S和N0，加速关节软骨蛋白多糖和胶原降解、促进软骨细胞凋亡，二是通过激活Fas途径介导软骨细胞的凋亡〔14,15〕，由于软骨基质的降解及软骨细胞的凋亡，引发软骨细胞生活的微环境恶化,从而影响软骨细胞的合成功能，使Ⅱ型胶原合成减少，加重软骨基质合成与降解的紊乱，加上软骨细胞凋亡的增加，导致关节软骨的破坏，促发OA的发生发展。

Hulth法通过切断前交叉韧带和副韧带，减弱了关节周围肌肉和韧带的保护作用，造成关节不稳定、关节面摩擦增加，部分半月板的切除使胫股关节应力改变，最终关节软骨退变而导致的发生。本研究说明，KOA动物模型复制成功，且在KOA发病过程中IL-1的失衡、MMP-1的释放、Ⅱ型胶原的降解以及软骨细胞的凋亡发挥了重要作用。

CT是一种抗骨吸收剂,通过与破骨细胞上的降钙素受体结合,抑制破骨细胞功能而用于治疗骨质疏松〔6,16〕,目前有研究表明关节软骨细胞上也有功能性CT受体，CT可使cAMP 表达增加,促进胶原蛋白和蛋白多糖表达而发挥保护软骨的作用〔17〕。本研究表明CT可能通过抑制IL-1β分泌，恢复软骨基质的合成与降解平衡，减少软骨细胞凋亡，对关节软骨具有一定的保护作用，延缓关节软骨退变过程。

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〔2014-12-31修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

郑州市科技发展计划(2007-15-44)

杨红梅(1969-)，女，教授，硕士，主要从事骨关节疾病的病理生理学研究。

尤笑迎(1969-)，男，医学硕士，主任医师，主要从事骨关节疾病的诊治研究。

R684.3

A

1005-9202(2016)15-3648-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.017

1河南医学高等专科学校