T细胞亚群及相关细胞因子在变应性鼻炎患者外周血中的表达及意义△

唱得龙　贾建平　张伟　胡晨　李洪波



T细胞亚群及相关细胞因子在变应性鼻炎患者外周血中的表达及意义△

唱得龙贾建平张伟胡晨李洪波

目的探讨变应性鼻炎(AR)患者外周血中T细胞亚群及其相关细胞因子的表达。方法收集34例AR患者(AR组)和20例健康志愿者(对照组)的外周血。采用流式细胞术(FCM)检测外周血中辅助性T细胞1(Th1细胞)、Th2、Th17细胞和CD4+CD25+调节性T细胞(Treg细胞)、Foxp3+CD4+CD25+Treg细胞百分比；同时检测血清中白细胞介素27(IL-27)、γ干扰素(IFN-γ)、IL-4、转化生长因子β1(TGF-β1)和IL-17的表达水平。结果AR组的Th1、Th17细胞百分比和Th1/ Th2细胞比例明显高于对照组，Th2细胞百分比明显低于对照组，Th1/ Th2比例明显失衡。AR组患者外周血CD4+CD25+Treg细胞和Foxp3+CD4+CD25+Treg细胞百分比明显低于对照组。AR组IL-4和IL-17表达明显高于对照组，IFN-γ、IL-27和TGF-β1明显低于对照组。结论 AR患者外周血中Th1/Th2、Th17/Treg细胞失衡是导致AR的重要原因。(中国眼耳鼻喉科杂志，2016，16：319-321)

T淋巴细胞亚群；细胞因子；鼻炎，变应性

变应性鼻炎(allergic rhinitis, AR)是耳鼻咽喉科发病率较高的疾病之一,是特异性个体接触致敏原后导致包括免疫球蛋白E(immunoglobulin E, IgE)介导的炎症递质释放和多种免疫活性细胞、细胞因子参与的鼻黏膜慢性炎症反应性疾病。其发生的必要条件有3个：特异性抗原即引起机体免疫反应的物质；特应性个体即所谓个体差异、过敏体质；特异性抗原与特应性个体相遇。目前研究认为，辅助性T细胞1(helper T cell 1, Th1)/Th2细胞免疫失衡是AR发病机制中的主要环节[1]。调节性T细胞(regulatory T cells, Tregs细胞)是一种抑制性T细胞，在自身免疫耐受中发挥重要作用，下调Th1和Th2细胞的促炎反应，阻止从早期的活化阶段向Th2细胞的分化阶段转变，限制了针对抗原的气道变应性炎症反应和过多的Th2细胞反应。CD4+Treg细胞是当前最受重视和投入研究最多的一类Treg细胞。本研究深入探讨AR的具体发病机制及寻求特异性治疗方法是鼻科学领域的研究热点。本文对AR的免疫危险因素进行研究分析。

1　材料与方法

1.1材料2015年1～8月本科收治的AR患者34例(AR组)，其中男性18例、女性16例；平均年龄为26.2岁。所有AR患者均符合诊断标准，且不伴哮喘及阿司匹林耐受不良等疾病，未经抗组胺和免疫治疗。20例来自本院的健康志愿者(对照组)，无呼吸道和变应性疾病史，其中男性11例、女性9例；平均年龄为27.6岁。所有受试者均在征得知情同意后接受实验。

1.2CD4+CD25+Treg细胞和Foxp3+CD4+CD25+Treg细胞检测取乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血50 μL，分别加入CD4-异硫氰酸荧光素(CD4 fluorescein isothiocyanate, CD4-FITC), CD25-藻红蛋白(CD25 phycoerythrin, CD25-PE)充分混匀，暗室孵育15 min；加入固定剂100 mL，15 min后，以磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)洗涤，1 500 转/min离心，弃上清液；加入100 μL破膜剂，30 min后，1 500 转/min离心，弃上清液；加入5 μL Foxp3-PE-CY5, 15 min后，加入200 μL PBS，即刻以流式细胞仪(FACS CANTO II)检测。

1.3Th1/Th2和Th17细胞检测取外周血200 μL，加入等体积1640培养液1∶1稀释均匀。加入19 μL PMA工作液(浓度为1 μg/mL)、6 μL离子霉素工作液(浓度为50 μg/mL)和6 μL莫能霉素工作液(0.1 mg/mL)。轻轻吹打均匀，置于37 ℃含5% CO2培养箱培养5 h。外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)管中加入CD4-FITC、CD8 抗原呈递细胞(CD8 antigen presenting cell, CD8-APC)和CD3-PE-CY7单克隆抗体，室温下避光反应15 min。PBS洗涤2次，加入破膜剂100 μL,室温下避光孵育15 min，PBS洗涤2次。加入IFN-γ-PE-CY5和IL-4-PE单克隆抗体共同混匀，室温下避光孵育20 min。用PBS洗涤2次后，以PBS 300 μL重悬细胞，即刻以流式细胞仪检测。

1.4Th1/Th2相关细胞因子检测利用流式细胞微球阵列技术(cytometric bead array, CBA)检测外周血中Th1/Th2相关细胞因子：白细胞介素27(interleukin 27, IL-27)、IL-4、IL-17、转化生长因子β1(transforming growth factor β 1, TGF-β1)和γ干扰素(interferon γ，IFN-γ)。静脉采血2 mL，分离血清于-70 ℃保存备用。用反应稀释液将5种细胞因子标准品稀释为5 000、2 500、1 250、625、312、156、80、40、20、10、5和0 pg/mL共12个梯度制订标准曲线。取待测血清和标准品50 μL置于上样管，加入50 μL混匀捕获微球，室温避光孵育1 h；然后加入50 μL检测抗体，室温避光2 h；加入1 mL洗液以200×g离心5 min，弃上清液；洗涤2次后，每管加入300 μL洗涤液重悬微球，上机以FACS DIVA软件获取数据。以FACP Array软件分析获取的数据。

2　结果

AR组患者Th1、Th17细胞百分比和Th1/ Th2细胞比例明显高于对照组，Th2细胞百分比明显低于对照组，Th1/ Th2细胞比例明显失衡。AR组患者外周血CD4+CD25+Treg细胞和Foxp3+CD4+CD25+Treg细胞的百分比明显低于对照组。AR组IL-4和IL-17表达明显高于对照组，而IFN-γ、IL-27和TGF-β1明显低于对照组，详见表1。

表1　2组外周血各T细胞亚群百分比及细胞因子表达水平

注：a示与正常对照组比较，P<0.01

3　讨论

AR是体外环境因素作用于机体产生的异常免疫反应。T淋巴细胞是来源于骨髓的多能干细胞，按照其功能和表面标志物的不同，可以分为多个种类：细胞毒性T细胞，调节/抑制性T细胞和记忆T细胞等。Th细胞在免疫反应过程中扮演中间过渡的角色,主要可以通过增生扩散来激活其他类型能产生直接免疫反应的免疫效应细胞,其主要的细胞表面标志物是CD4。Th细胞又可以分为Th1、Th2、Treg和Th17等不同亚型细胞。Th1/Th2细胞平衡是维持正常细胞免疫和体液免疫所必需的，平衡失调则可能导致异常的免疫应答。本研究结果显示，AR组患者Th1细胞明显高于对照组，Th2细胞明显低于对照组，Th1/Th2细胞比例明显失衡。Th17细胞是近年发现的一种新型CD4+效应T细胞亚群，由TGF-β和IL-6诱导，可分泌IL-17和少量IL-22，介导自身免疫性疾病和组织炎症。有学者[2]研究表明,给予花粉变应原刺激后的AR患者，其外周血Th17细胞的比例增高。本研究结果显示，AR组患者Th17细胞百分比明显高于对照组。

CD4+CD25+Treg细胞主要来源于胸腺，占正常人外周血CD4+T细胞的5%～10%。Treg细胞表达多种表面分子，其中叉头/翼状螺旋转录因子3(forkhead box protein-3，Foxp3)是Treg细胞的特异性标志。Th17细胞属于“促炎性的细胞”，而Treg细胞属于“抑炎性的细胞”，两者的平衡是维持机体正常稳定免疫状态所必需。本研究结果显示，AR患者外周血Th17细胞百分比明显高于对照组，CD4+CD25+Treg细胞百分比明显低于对照组,提示Th17细胞与Treg细胞免疫失衡可能是AR发病的重要原因。有学者[3]研究发现，AR患者的鼻黏膜及PBMC中的Foxp3+CD4+CD25+Treg细胞数和Foxp3+CD4+CD25+Treg mRNA 表达明显低于对照组,与本研究结果一致。因此我们可以推测,Foxp3+CD4+CD25+Treg细胞数量的减少可能引起Treg细胞对Th2型细胞反应的抑制作用减弱,从而导致AR的发生。

IL-27是新型的Th1型细胞因子，主要功能是促进初始CD4+T细胞向Th1细胞方向分化, 并抑制其向Th2和Th17细胞方向分化。Shimanoe等[4]发现，体内注射IL-27可以明显缓解小鼠的迟发型变态反应, 且其体内IL-17含量较对照组明显降低。在小鼠哮喘模型中，IL-27抑制Th2型细胞反应和变应性炎症[5]。本研究结果显示，IL-27在AR患者中表达下降，从而导致Th1细胞因子IFN-γ表达下降，Th2细胞因子IL-4表达升高，引起Th1、Th2细胞调节紊乱而导致AR的发生。IL-17 是Th17细胞的重要效应因子，其主要功能是促进炎性反应。有学者[6]研究发现，在AR患者的血清中也检测到IL-17，其表达水平明显高于对照组。Ciprandi等[7]研究发现，AR患者血清中IL-17的水平与AR临床症状的严重程度呈正相关。TGF-β1是影响Th17 细胞分化关键的细胞因子，同时也是Treg细胞功能的重要调节因子。低水平的TGF-β1能诱导RORγt 的产生，而高水平的TGF-β1 能够上调Foxp3的表达，因此，细胞因子调节的RORγt / Foxp3 平衡决定了初始T细胞受抗原刺激后向Th17细胞或Treg细胞方向分化[8]。本研究结果显示,AR组TGF-β1水平低于对照组。由此可推测，TGF-β1是调节Th17细胞和Treg细胞之间平衡稳定的重要细胞因子。

综上所述，AR患者外周血中Th1/Th2细胞和Th17/Treg细胞平衡在AR发病中可能起着关键作用，进一步研究Th1/Th2细胞和Th17/Treg细胞功能可为AR的发病机制提供新的理论依据。

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[2]Ciprandi G,Filaci G，Battaglia F，et al．Peripheral Th-17 cells in allergic rhinitis：new evidence[J]．Int Immunopharmacol，2010，10(2)： 226-229．

[3]Xu G，Mou Z，Jiang H，et al．A possible role of CD4+CD25+T cells as well as transcription factor Foxp3 in the dysregulation of allergic rhinitis[J].Laryngoscope，2007，117(5)：876-880．

[4]Shimanoe Y, Miyazaki Y, Hara H, et al. Amelioration of experimental allergic rhinitis with suppression of topical immune responses by lack of IL-27/WSX-1 signaling[J].Ann Allergy Asthram Immunol, 2009, 102(3):223-232.

[5]Fujita H, Teng A, Nozawa R, et al. Production of both IL-27 and IFN-gamma after the treatment with a ligand for invariant NK T cells is responsible for the suppression of Th2 response and allergic inflammation in a mouse experimental asthma model[J].J Immunol,2009,183(1):254-260.

[6]巴罗，杜进涛，刘亚峰，等.鼻息肉及变应性鼻炎中IL-17表达与嗜酸性粒细胞浸润的意义[J]．临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2010，24(2):53-56．

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(本文编辑杨美琴)

Expression of T cell subsets and related cytokines in peripheral blood of patients with allergic rhinitis and its significance

CHANGDe-long，JIAJian-ping，ZHANGWei，HUChen，LIHong-bo.

DepartmentofOtolaryngology-HeadandNeckSurgery,thePeople′sLiberationArmyNo. 463Hospital,Shenyang110000 ,China

LI Hong-bo, Email: gemmill1945@qq.com

ObjectiveTo investigate the expression of T lymphocyte subgroups, regulatory T cells and related cytokines in peripheral blood of patients with allergic rhinitis (AR).MethodsPeripheral blood from 34 AR patients (AR group) and 20 healthy volunteers (control group) was collected. Flow cytometry (FCM) was used to detect the percentage of helper T cell 1 (Th1 cell), Th2 cell, Th17 cell, CD4+CD25+regulatory T (Treg cell) and Foxp3+CD4+CD25+Treg cell, and the expression of interleukin 27 (IL-27), interferon γ (IFN-γ), IL-4, transforming growth factor β 1 (TGF-β1) and IL-17 in the peripheral blood. ResultsThe percentage of Th1 cells, Th17 cells and Th1/Th2 was all higher in AR group than those in the control group, while the percentage of Th2 cells was lower than that in the control group. The proportion of Th1/Th2 imbalance was obvious. The percentage of CD4+CD25+Treg cells and Foxp3+CD4+CD25+Treg cells was lower in AR group than those in the control group. The expression of IL-4 and IL-17 was higher in AR group than those in the control group, while IFN-γ, IL-27 and TGF-β1 was lower in AR group than those in the control group. ConclusionsThe imbalances of Th1/Th2 and Th17/Treg cells in the peripheral blood were the important causes of AR. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2016,16:319-321)

T-lymphocyte subsets; Cytokine; Rhinitis, allergic

辽宁省博士科研启动基金(201501135)

中国人民解放军第463医院耳鼻咽喉头颈外科沈阳110000

李洪波(Email: gemmill1945@qq.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2016.05.004

2015-10-13)