水稻矮秆多分蘖突变体mz3的遗传分析和基因定位

2016-10-25苏晓妹方宇星刘钰龙刘峰张所兵张云辉鲍依群

中国水稻科学 2016年5期

苏晓妹　方宇星　刘钰龙　刘峰　张所兵　张云辉，*　鲍依群，*

(1南京农业大学生命科学学院，南京 210095；2江苏省农业科学院粮食作物研究所/江苏省农业种质资源保护与利用平台，南京 210014；*通讯联系人， E-mail: baoyiqun@njau.edu.cn, zyhrice@163.com)

苏晓妹1方宇星1刘钰龙1刘峰1张所兵2张云辉2，*鲍依群1，*

SU Xiaomei, FANG Yuxing, LIU Yulong, et al. Genetic analysis and gene mapping of a dwarf and high-tillering mutantmz3 in rice (OryzasativaL.). Chin J Rice Sci, 2016, 30(5): 479-486.

通过EMS诱变粳稻品种中花11获得一个稳定遗传的矮秆多分蘖突变体mz3。遗传分析表明该突变性状受一对隐性基因控制，并利用mz3与籼稻品种南京11杂交建立的F2群体，将该基因定位在水稻第6染色体长臂上的SSR标记RM19353与RM510之间约747 kb范围内。由于该区间包含控制水稻株高和分蘖的D3基因，结合表型分析，推测突变基因与D3可能为一对等位基因。设计7对引物分别对中花11与突变体mz3的基因进行测序，结果显示，与中花11相比，D3基因在mz3中第636位核苷酸由G突变为A，使得编码色氨酸的密码子TGG突变为终止密码子TGA，导致翻译提前终止。进一步对定位群体中10个隐性极端个体测序，结果显示所有极端个体都带有该突变位点。亚细胞定位结果表明，突变体编码的D3蛋白与野生型一样定位在细胞核中，荧光双分子互补试验结果表明，突变体D3蛋白不能与D14蛋白发生互作，推测突变体编码的D3截短蛋白缺少了与D14互作的氨基酸序列，从而阻碍了独脚金内酯信号传递。因此，mz3表型很可能由D3基因突变引起。

水稻；矮秆多分蘖； D3；基因定位

20世纪60年代，半矮秆基因sd1的成功应用掀起了水稻生产上的一次“绿色革命”，第一次实现了矮秆基因在育种中的应用，使水稻的产量提高了20%～30%[1]。目前，已经发现和鉴定的水稻矮秆突变体超过60个[2]，其中30多个水稻矮秆基因被克隆[3]。有研究表明，水稻的株高与分蘖数负相关[4-5]，而株高与分蘖数量在一定程度上决定了水稻的产量[6]。通过对水稻分蘖机制的研究，多个与水稻分蘖相关的基因已被克隆[7]。其中，控制水稻分蘖的MOC1基因已被克隆，它能促进分蘖芽的形成和发育，并能控制腋生分生组织的分化，该基因功能缺失突变体表现为单分蘖[8]。2008年Gomez-Roldan[9]等发现了一类新型的由倍半萜衍生而来的植物激素——独脚金内酯(strigolactones, SLs)，参与调控植物地上部分枝发育。SLs合成或信号途径的相关基因发生突变，通常会造成植物分蘖或分枝数目的增加或减少，同时伴有株高变化[10]。SLs主要在植物根部合成，向上运输来抑制植物侧枝的生长，它对侧枝发育的调节，是一个与植物生长素和细胞分裂素相互作用的复杂网络调控系统[9-11]。

SLs和脱落酸的合成一样都是以类胡萝卜素为前提，经MEP途径开始进行合成[12-13]。目前了解到的调控合成的基因有四类：MAX3(同源基因为RMS5/D17/DAD3)编码类胡萝卜素裂解双加氧酶CCD7，是SLs 合成过程中发现的第一个关键酶；MAX4(同源基因为RMS1/D10/DAD1)编码类胡萝卜素裂解双加氧酶CCD8，在CCD7 的下游起作用；D27/AtD27，编码铁结合蛋白；这三种基因参与独脚金内酯合成的第一步反应，在质体内进行，之后在质体外进行合成的相关基因有MAX1，负责编码细胞色素P450[10，12-16]。而目前在不同植物中发现参与调控SLs信号转导途径的基因一共有三种：MAX2/RMS4/D3、D14/DAD2和D53/SMAX1[13]。MAX2/RMS4/D3编码一类F-box转录因子蛋白，通过形成SCF (Skp1-Cullin-F-box)蛋白复合体，参与SLs信号的接收和转导过程，能介导泛素化蛋白的降解；D14/DAD2编码α/β水解酶，可能是SLs的受体[17-19]；水稻D53编码一个在结构上与I类Clp ATP酶类似的蛋白，是独脚金内酯(SLs)信号途径的抑制因子。在SLs存在的条件下与D14、D3形成蛋白复合体，D53蛋白被泛素化降解导致去抑制化，从而激活SLs信号转导[20-21]。

本研究从表型、遗传等方面对矮秆多分蘖突变体mz3进行鉴定，明确了相应的遗传特性，并对突变基因进行了精细定位——基因测序与突变位点分析，还进一步进行了亚细胞定位与双分子荧光互补分析。通过对该突变体的研究，有利于进一步了解水稻株型的分子机理，为株型育种提供理论依据。

1　材料与方法

1.1实验材料

水稻矮秆多分蘖突变体mz3是从粳稻品种中花11的甲基磺酸乙酯(EMS)诱变群体中筛选得到的，经过多代的自交观察，该突变体的遗传性状稳定。在正常生长条件下，成熟期随机选取野生型与突变体各10株，对株高、分蘖数、每穗粒数、千粒重、结实率、粒长、粒宽和粒厚等相关农艺性状进行考查和统计分析。

以该突变体mz3与籼稻品种南京11杂交，构建F2群体。从F2中挑选出106个具有矮秆多分蘖表型的单株，用于基因的精细定位。

1.2基因的连锁分析

选用实验室已有的均匀分布于水稻12条染色体上的463对SSR标记，以亲本中花11的DNA作为模板，进行PCR扩增，筛选mz3与南京11之间存在的多态性标记。在F2群体中挑选10株突变体表型的单株，利用这些多态性标记对突变基因进行连锁分析。

用CTAB小量法提取水稻基因组DNA[6-7]。采用10 μL 的PCR 扩增体系，其中含10 ng DNA 模板，4 nmol 引物，0. 5 mmol dNTP，1 μL 10 × 缓冲液和0. 5 UTaq聚合酶。PCR条件如下: 94℃下预变性5 min;94℃下变性30 s，55℃下退火30 s， 72℃下延伸30 s， 33个循环; 72℃下延伸5 min。扩增产物经19∶1非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (电泳缓冲液0.5×TBE，电压180 V，时间2.0 h)，快速银染后观察、照相、读带[22]。

1.3SSR标记的开发与基因定位

根据初步定位结果，从已经公布的水稻SSR标记[23]中选择合适的位点进行标记开发，引物设计通过Primer Premier 5.0软件进行。利用开发的多态性标记对定位区间进行标记加密，通过染色体步移逐步缩小目标区段。

1.4突变基因测序与后代验证

通过水稻基因组注释计划(Rice Genome Annotation Project ，RAP-DB, http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)对最终定位区间进行基因预测。发现与水稻分蘖相关的D3基因(Os06g0154200)位于区间内。因此，设计了7对引物，对中花11和突变体mz3的D3基因编码区以及启动子区进行扩增、测序和比对，并在定位群体中随机挑选10个隐性极端单株对突变位点进行验证。

1.5亚细胞定位

分别将野生型与mz3突变体中D3蛋白与GFP进行融合，得到1305-D3WT-GFP和1305-D3MT-GFP两个载体，后将载体分别转入农杆菌菌株EHA105中。将所得农杆菌注射进烟草表皮，培养2 d后采用激光共聚焦显微镜观察。MADS53-mRFP作为细胞核定位标记。

1.6D3、D14蛋白互作分析

将D3WT、D3MT基因分别克隆到载体p2YC中，将D14WT的基因克隆到载体p2YN中，后将载体分别转入农杆菌菌株EHA105中。将所得农杆菌注射进烟草表皮，培养2 d后利用激光共聚焦显微镜观察。MADS53-mRFP作为细胞核定位标记。

2　结果与分析

2.1突变体表型分析

表型调查结果表明，突变体mz3的株高降至野生型中花11的61.8%，分蘖数增加2.8倍(图1)。对成熟期其他农艺性状进行调查，发现突变体mz3的每穗粒数显著减少，粒长、粒宽、粒厚显著降低，千粒重显著降低，但结实率与野生型相比没有显著差异(图2)。

2.2遗传分析

将mz3分别与野生型中花11和南京11杂交，结果显示2个杂交组合的F1代均表现正常性状。在mz3/南京11的F2定位群体中，随机抽取204个单株调查，发现正常表型的157株，突变体表型的47株，符合3∶1分离比(X2=0.32)，表明该矮秆多分蘖表型由一对隐性基因控制。

图1野生型中花11与突变体mz3的表型

Fig.1. Phenotype of wild type Zhonghua 11 and mz3.

2.3连锁分析与精细定位

选用实验室已有的均匀分布在水稻12条染色体上的463对SSR引物标记，用两个亲本(mz3、南京11)DNA作模板进行多态性分析。共筛选出具有多态性的引物155对，多态性频率为33.48%。利用筛选出来的155对多态性引物对F2群体中随机选取的10株突变个体进行连锁分析，发现突变基因与水稻第6染色体长臂端的两个SSR标记RM190和RM510紧密连锁。

根据已经公布的SSR标记图谱[23]，在RM190和RM510附近重新开发了9个SSR标记。其中6个在亲本间具有多态性，并利用这些多态性标记对mz3/南京11杂交F2群体中的106个单株进行分析。最终将突变基因定位在RM19353和RM510标记之间，与RM19391共分离，物理距离约为747 kb(图3)。

2.4候选基因分析

测序结果显示，mz3编码区的第636位碱基由G突变成A，密码子由TGG变为终止密码子TGA，翻译提前终止(图4-A)。在mz3/南京11的F2定位群体中随机选取10株隐性极端个体单株，以测序引物CX-3F/CX-3R扩增包含突变位点的区段进行测序。结果显示这10个极端个体都带有与mz3相同的突变位点(图4-B)，再次证明突变表型很可能由D3基因的单碱基突变引起。

2.5亚细胞定位与双分子荧光互补分析

为了初步阐明mz3突变体的突变机理，我们首先对野生型及突变型的D3蛋白进行了亚细胞定位分析。野生型中花11的D3蛋白主要定位在细胞核中(图5-A)，而突变型的D3蛋白同样能够正确定位到细胞核中(图5-B)。进一步利用双分子荧光互补试验检测了野生型及突变型D3蛋白与D14的互作情况，结果表明，虽然突变型的D3蛋白能够定位在核中，但其不能与D14蛋白在细胞核中发生互作(图6-B)，而野生型的D3与D14能够在核中结合(图6-A)。

**表示0.01水平上差异显著; ns表示差异不显著。

**P<0.01; ns, Not significantly different by Student’st-test.

图2野生型与突变体的农艺性状对比

Fig. 2. Comparison of the agronomic traits of wild type Zhonghua 11 and mz3.

图3突变基因的精细定位

Fig. 3. Fine mapping of the mutant gene.

3　讨论

目前，不同的研究者通过不同的诱变方法获得了多个水稻D3基因突变体[24-26]，它们的共同点是都表现出矮秆多分蘖。但由于诱变材料背景不同、基因发生突变的位点不同，表型也有一定的差异。如Ishikawa等[24]鉴定出的d3突变体籽粒变小，但枝梗数目、穗大小和小穗育性没有明显改变；段远霖等[25]鉴定出的det1突变体表现出明显的生殖发育缺陷，如一、二次枝梗数和穗粒数减少、籽粒变小且育性大幅下降。这些突变体的表型特征提示，D3在水稻生长发育的调解中具有多效性作用。本研究获得的mz3突变体株高是野生型的61.8%(图1)，分蘖数增加2.8倍，每穗粒数显著减少，但结实率正常(图2)。突变体的粒长、粒宽和粒厚均显著下降，千粒重也因此显著降低(图2)。

A-突变体mz3的基因突变位点； B-10株隐性极端个体e1～e10测序结果。 ZH11，中花11(野生型)。

A， Mutation site ofmz3; B, Sequencing results of 10 extreme recessive individuals (e1-e10). ZH11, Zhonghua 11(wild type).

图4候选基因的序列分析与后代验证

Fig. 4. Sequence analysis of candidate gene and offspring validation.

A-野生型的D3蛋白定位在细胞核中； B-突变型的D3蛋白定位在细胞核中 (Bar=10 μm)。

A, D3 protein of wild type located in the nuclei; B, D3 protein of the mutant located in the nuclei (Bar=10 μm).

图5D3蛋白的亚细胞定位

Fig. 5. Subcellular localization of D3 protein.

A-野生型的D3与D14能够在核中结合； B-突变体的D3蛋白不能与D14蛋白在细胞核中发生互作; C-野生型的D3与p2YN空载体共转化； D-突变体的D3与p2YN空载体共转化； E-p2YC空载体与D14共转化。(Bar=10 μm)

A, Wild type D3 can interact with D14 in the nuclei; B, Mutant D3 can not interact with D14 in the nucleus; C, Co-transformation of wild type D3 with empty p2YN vector; D, Co-transformation of mutant D3 with empty p2YN vector; E, Co-transformation of empty p2YC vector with D14. (Bar=10 μm).

图6D3与D14的双分子荧光互补分析

Fig. 6. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of D3 and D14.

D3基因编码一个富含亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat)的F-box蛋白，与拟南芥的MAX2/ORE9 同源。F-box蛋白通常作为SCR类型E3连接酶的亚基，将底物蛋白多聚泛素化，由26S蛋白酶体将其降解。2013年我国两个研究组同时在水稻中发现了D3的底物D53，它是独脚金内酯(SLs)信号途径的抑制子[20-21]。由此，D3、D53和SLs的受体D14共同组成了水稻中SLs信号的关键因子。即当SLs存在时，D14接收信号促使形成D53-D14-SCFD3复合体介导D53被26S蛋白酶体降解。D53降解后，SLs信号传递下去，发挥抑制水稻分蘖的功能；如果D53不能被降解，SLs信号阻断，不能发挥抑制水稻分蘖的作用，引起多分蘖表型。因此，D3、D14和D53之间的互作是传递SLs信号的关键，其中D3和D14、D14和D53之间的互作依赖SLs的存在，而D3和D53的互作与SLs存在与否无关[20-21,26]。在本研究中，我们首先对野生型和mz3 突变体的D3进行亚细胞定位，结果表明野生型的D3蛋白能定位在细胞核中(图5)，这与前人的报道一致[20,26]。mz3 突变体的D3蛋白也能正确定位在细胞核中。进一步通过BiFC证实，突变体的D3蛋白不能与D14发生互作，而相同条件下野生型的D3蛋白可以与D14互作(图6)。这些结果说明，mz3 突变体中提前终止的D3基因编码的截短蛋白保留了有功能的定位信号，使其能够正确定位到细胞核中，但缺少能够与D14蛋白发生互作的氨基酸序列，从而影响了其正常的生物学功能，造成突变表型。

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Genetic Analysis and Gene Mapping of a Dwarf and High-tillering Mutant mz3 in Rice (Oryza sativa L.)

SU Xiao-mei1, FANG Yu-xing1, LIU Yu-long1, LIU Feng1, ZHANG Suo-bing2, ZHANG Yun-hui2,*, BAO Yi-qun1,*

(1College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;2Jiangsu Provincial Platform for Conservation and Utilization of Agricultural Germplasm/Institute of Food Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;*Corresponding author, E-mail: baoyiqun@njau.edu.cn, zyhrice@163.com)

A dwarf and high-tillering mutant, temporarily termed asmz3 was obtained from Zhonghua 11, ajaponicarice variety by EMS mutagenesis. Genetic analysis indicated that the mutant phenotype was controlled by a recessive gene. An F2population was developed by crossingmz3 with Nanjing 11, anindicarice variety for mapping of the mutant gene, which was ultimately restricted within a physical distance of about 747 kb between two SSR markers RM19353 and RM510 on the long arm of rice chromosome 6. Gene prediction revealed thatD3, a gene conferring rice plant height and tiller number was located in this region. Sequence analysis identified a single G to A nuclear acid substitution at the position 636 from the ATG start codon, forming a premature translational termination codon. Sequencing of 10 randomly selected recessive plants frommz3/Nanjing 11 mapping population confirmed the same mutation site carried by the 10 individuals. Subcelluar location indicated that D3 protein of the mutant was located in the nuclei as wild type. BiFC analysis showed that D3 protein of the mutant could not interact with D14 protein for lacking of essential amino acids that bind with D14, blocking signal transduction of strigolactones. So we speculated that the mutant phenotype ofmz3 was probably caused by mutation inD3 gene.

rice; dwarf and high-tillering; D3; gene mapping

2016-03-04；修改稿收到日期: 2016-05-02。

国家自然科学基金资助项目(31401036)；江苏省自然科学基金资助项目(BK20130706)；江苏省农业科技自主创新资金资助项目[(CX(14)5005)]；江苏省农业科学院基本科研业务专项[(ZX(15)4015)]。

Q343.5; Q511.032

1001-7216(2016)05-0479-08

苏晓妹, 方宇星, 刘钰龙, 等. 水稻矮秆多分蘖突变体mz3的遗传分析和基因定位. 中国水稻科学， 2016， 30(5)： 479-486.