TiO2纳米管阵列孔径调控葡萄糖氧化酶生物传感器性能

饶超，董依慧，庄伟，邬新兵，洪启亮，刘畅，陆小华



TiO2纳米管阵列孔径调控葡萄糖氧化酶生物传感器性能

饶超1，董依慧1，庄伟2，邬新兵1，洪启亮1，刘畅1，陆小华1

（1南京工业大学材料化学工程国家重点实验室，江苏南京 210009；2南京工业大学国家生化工程技术研究中心，江苏南京 211816）

采用电化学阳极氧化法制备出不同孔径（21、62、83、102 nm）的TiO2纳米管阵列（TNA），研究了孔径对固定化葡萄糖氧化酶（GOx）的传感器性能的影响。循环伏安测试结果表明固定在不同孔径大小的TNA上的GOx在葡萄糖溶液中均具有良好的酶活性。计时电流法和交流阻抗法测试发现，当孔径是83 nm时，灵敏度达到最大值27.2 μA·(mmol·L-1)-1·cm-2。调控TNA的孔径可改变固定化GOx的活性及溶液扩散阻抗，从而显著提高生物传感器性能。

葡萄糖氧化酶；TiO2纳米管阵列；孔径；扩散阻抗；电化学；生物传感器；制备；生物过程

引 言

电化学葡萄糖生物传感器作为一种新型检测方法，具有灵敏度高、分析速率快、复杂环境中连续检测等优点，在食品分析、水质监测及临床检测等领域有重要用途[1-3]。商业化的葡萄糖生物传感器包括单独的电极、葡萄糖氧化酶（GOx），但每次检测都要更换酶，因而成本太高。自从1962年Clark等[4]提出将酶固定在电极上构成酶电极的思路以来，文献广泛报道了各种电极材料固定化葡萄糖氧化酶的传感器效果[5-6]，包括碳纳米管[7]、石墨烯[8-9]和氧化钛等，而氧化钛由于无毒、廉价、稳定的物理化学性质和优良的生物相容性被广泛研究用于制备酶电极[10-12]。电化学阳极氧化法制备的TiO2纳米管阵列更是具有比表面积大、孔道高度规整、孔径范围可调等优点，在酶电极领域受到广泛重视[13]。

目前，提高氧化钛的生物传感器性能包括提高电子传导能力，通常对材料表面进行化学改性，如碳化改性[14-15]、石墨烯改性[16-18]以及贵金属负载[14,16]等，但表面化学改性过程复杂、成本高和生物相容性低，而且改善效果不如人意。Kang等[19]将20 nm左右的PtAu纳米粒子沉积在TiO2纳米管上制备了葡萄糖传感器，其线性范围为0～1.8 mmol·L-1，灵敏度为0.08 μA·(mmol·L-1)-1·cm-2。Feng等[20]在TiO2纳米管中负载Ag纳米粒子，制备的葡萄糖传感器线性范围为0.1～4 nmol·L-1，灵敏度为 0.39 μA·(mmol·L-1)-1·cm-2。而物理形貌调控酶活性及扩散阻抗方向却鲜有报道。前期研究结果发现溶液扩散阻抗与基底材料的孔径有关，孔径越大，孔扩散系数越大[21-23]，扩散阻抗相应地越小。另外，在纳米受限情况下，固定化GOx的二级结构可能会因受到电极材料的纳米形貌（孔径）影响而发生改变，从而影响GOx的活性[24-26]。综上所述，适当地改变孔径不仅可以提供良好的酶固定化场所，保留酶活性，并且可以降低溶液扩散阻抗，从而提高传感器性能，并且不会影响TiO2的生物相容性。

本课题组以钛酸盐为前体，采用固相分离法制备出高比表面积的介孔TiO2材料。其中An等[27]采用原子力显微镜研究发现材料的纳米形貌对BSA与界面之间的微观作用力影响很大；董依慧等[28]使用高效液相色谱发现蛋白质的吸附行为与基底材料的纳米形貌有关；纪拓等[29]研究发现蛋白质的吸附行为与复合材料的纳米形貌相关；邬新兵等[12]研究发现介孔TiO2是良好的电化学葡萄糖传感器材料，并发现这种材料的纳米结构能很好地保留GOx活性。综合课题组基础，蛋白质的吸附与活性受载体纳米结构影响很大。因此，基于前述问题和课题组基础，本研究以乙二醇为溶剂、氟化铵为腐蚀剂，通过控制阳极氧化外加电压制备出不同孔径TiO2纳米管阵列，采用物理吸附法固定化GOx制备出GOx/TNA传感电极，系统地考察因孔径引起的GOx催化活性和扩散阻抗的改变及其机理分析，以及最终对葡萄糖传感器电极灵敏度的影响。

1 实验部分

1.1 实验试剂

金属钛片（0.25 mm），99.7%，SIGMA-ALDRICH；氟化铵（NH4F），ACS，98%；乙二醇（C2H6O2），AR，上海试四赫维化学有限公司；无水乙醇（C2H6O），AR，上海凌峰化学试剂有限公司；葡萄糖氧化酶（GOx），G2133-10KU，Type Ⅶ，192 unit·mg-1；磷酸二氢钠（NaH2PO4），AR，西陇化工股份有限公司；磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O），AR，上海凌峰化学试剂有限公司；铁氰化钾[K3Fe(CN)6]，AR，上海凌峰化学试剂有限公司；亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6·3H2O]，AR，上海凌峰化学试剂有限公司；去离子水，自制。

1.2 TiO2纳米管阵列的制备

金属钛片裁剪成1.0 cm×2.5 cm，在去离子水和无水乙醇中各超声清洗10 min，重复3次后，常温下用氮气吹干。电解液采用乙二醇作溶剂、0.4%的氟化铵作为腐蚀剂，并含有1%的去离子水。电解池中盛放50 ml电解液，预处理的钛片作阳极，钛片浸入面积是1.0 cm×1.8 cm，铂片作阴极，两电极平整对齐。采用变电压法，先在5 V电压下反应12 h，再分别在10、20、30、40 V电压下反应12 h，得到TiO2纳米管阵列，分别记作TNA-10、TNA-20、TNA-30、TNA-40。将制备得到的TiO2纳米管阵列放入去离子水中超声清洗10 min去除表面覆盖层，得到表面均匀无遮盖的TiO2纳米管阵列。最后将制备好的材料高温烧结，处理过程为：以2℃·min-1的速率升温至500℃，保温2 h，然后自然降温至60℃，取出，保存在干燥环境下。

1.3 TiO2纳米管阵列的组成和结构表征

采用法国Horiba Jobin Yvon公司的HR 800型拉曼光谱仪(Raman)分析TiO2材料表面组成信息，He-Cd激光，激光波长514 nm，激光功率20 mW，扫描范围100～1800 cm；材料表面及断面形貌采用日立公司的Hitachi S-4800型场发射电镜（FESEM）观察，放大倍数1 k～100 k，加速电压10 kV。

1.4 TiO2纳米管阵列传感电极的制备

（1）电极的制备：TiO2纳米管阵列使用银胶连接银线，在150℃下烘干固化30 min，得到TiO2纳米管阵列电极。

（2）GOx溶液的配制：先采用NaH2PO4及Na2HPO4·12H2O配制pH7.0的0.1 mol·L-1磷酸缓冲液，然后用该磷酸缓冲液作为溶剂，配制5 mg·ml-1GOx溶液。

（3）传感电极的制备：4℃下将制备好的电极浸入GOx溶液中，24 h后将电极取出，使用去离子水冲洗，4℃下冷冻干燥保存。将对应的传感电极分别命名为电极GOx/TNA-10、电极GOx/TNA-20、电极GOx/TNA-30、电极GOx/TNA-40。

1.5 电化学测试

在25℃下，使用电化学工作站（Autolab 302N，瑞士万通）进行电化学性能测试，采用标准的三电极体系。经GOx修饰的TiO2纳米管阵列电极作为工作电极，电极面积为1.8 cm2；Pt片电极作为对电极；Ag/AgCl 电极（饱和KCl溶液）为参比电极。采用循环伏安法（氮气饱和气氛及空气饱和气氛下）、计时电流法和交流阻抗法进行葡萄糖传感器性能测试。

2 结果与讨论

2.1 TiO2纳米管阵列的Raman表征

Raman光谱分析是通过入射激光的非弹性衍射检测物质内的化学键，可以给出全面的表面性质，在表面具有比XRD更高的灵敏度，可以检测出微量物质。图1是TNA-10、TNA-20、TNA-30、TNA-40的Raman谱图，样品的峰位置在145、197、395、515、638 cm-1，分别与锐钛矿相g、g、1g、1g/1g、g对应[27]，因此TiO2纳米管阵列的晶型是锐钛矿。锐钛矿具有良好的电子传输性能，是电化学传感器的良好使用材料[30]。

图1 TiO2纳米管阵列的Raman谱图

2.2 TiO2纳米管阵列的FESEM表征

采用FESEM对TiO2纳米管阵列进行微观形貌表征，包括纳米管阵列的垂面结构及断面结构。图2(a)、(c)、(e)、(g)分别是TNA-10、TNA-20、TNA-30、TNA-40的垂面结构的FESEM图，所对应的孔径大小分别是21、62、83、102 nm，并且从TNA平面可以看出纳米管孔均匀分布，而且是高度规整的圆孔。图2(b)、(d)、(f)、(h)分别是TNA-10、TNA-20、TNA-30、TNA-40的断面结构的FESEM图，可以看出TNA-10、TNA-20、TNA-30、TNA-40的断面呈规整有序的圆柱形孔结构，并且管与管之间紧密相连。图中具有规整垂面结构和断面结构的TNA适合GOx的固定化[13]。

图2 TiO2纳米管阵列的FESEM图像

2.3 电化学测试

2.3.1 循环伏安法 采用循环伏安法研究固定化GOx的活性信息。循环伏安法可以有效地给出电极表面发生的氧化还原反应信息，电极表面发生了氧化还原反应在特定的电压下会有氧化还原特征峰。图3是电极GOx/TNA-10、GOx/TNA-20、GOx/TNA-30、GOx/TNA-40的循环伏安曲线，测试条件是饱和氮气气氛下，pH7.0，0.1 mol·L-1PBS缓冲液，扫描速率为10 mV·s-1，葡萄糖浓度分别是2、4、6、8、10、20 mmol·L-1。可以看出电极GOx/TNA-10、GOx/TNA-20、GOx/TNA-30、GOx/TNA-40在不同浓度的葡萄糖环境下，循环伏安曲线平滑，分别有一个很强的氧化峰和还原峰，氧化峰的位置在-0.32 V左右，还原峰的位置在-0.36 V左右，结果表明在葡萄糖溶液中电极表面发生了氧化还原反应。这是因为，在温度为25℃、pH7.0 PBS缓冲液条件下，葡萄糖氧化酶的活性中心黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)通过接受电子及释放电子发生如式（1）和式（2）[13]所示的氧化还原反应，说明固定在TiO2纳米管阵列上的GOx保留了很好的生物酶活性。

图3 饱和氮气气氛、不同葡萄糖浓度下GOx/TNA循环伏安曲线

为了更进一步测试GOx/TNA电极的传感性能，在室温25℃，饱和空气气氛下，pH7.0，0.1 mol·L-1PBS缓冲液，做葡萄糖浓度分别是2、4、6、8、10、20 mmol·L-1的循环伏安法测试，循环伏安曲线如图4所示。与饱和氮气的循环伏安曲线相比，同样也出现了一对明显的氧化峰和还原峰，氧化峰位置在-0.32 V，还原峰位置在-0.38 V。但是相比于饱和氮气的条件下，饱和空气的循环伏安曲线峰电流明显增大，这是因为缓冲液中的溶解氧发生了如下反应[13]

图4 饱和空气气氛、不同葡萄糖浓度下GOx/TNA循环伏安曲线

从饱和空气和饱和氮气下的循环伏安曲线可以看出，电极GOx/TNA-10、GOx/TNA-20、GOx/TNA-30、GOx/TNA-40都发生了氧化还原反应，从而可知固定化的GOx表现出良好的酶催化活性。

2.3.2 计时电流法 在饱和空气气氛、氧化电位-0.32 V的条件下，通过计时电流评价GOx/TNA的葡萄糖传感器灵敏度性能，如图5所示。从图5(b)、(d)、（f）、（h）可以看出，在0～0.6 mmol·L-1区间，响应电流随葡萄糖溶液浓度呈线性变化。电极GOx/ TNA-10的线性化拟合方程是/μA·cm-22.89 μA·(mmol·L-1)-1·cm-2×/mmol·L-1(20.9923)，方程的斜率即是灵敏度2.89 μA·(mmol·L-1)-1·cm-2；电极GOx/TNA-20的线性化拟合方程是/μA·cm-215.3 μA·(mmol·L-1)-1·cm-2×/mmol·L-1(20.9880)，故其灵敏度是15.3 μA·(mmol·L-1)-1·cm-2；电极GOx/TNA-30的线性化拟合方程是/μA·cm-227.2 μA·(mmol·L-1)-1·cm-2×/mmol·L-1(20.9899)，因此灵敏度大小是27.2 μA·(mmol·L-1)-1·cm-2；电极GOx/TNA-40的线性化拟合方程是/μA·cm-217.2 μA·(mmol·L-1)-1·cm-2×/mmol·L-1(20.990)。从而可知，在孔径变化范围为20～102 nm范围内灵敏度性能先增加后减少，其中在孔径为83 nm时灵敏度达到最大值27.2 μA·(mmol·L-1)-1·cm-2。

在区间0～0.6 mmol·L-1后，每次增加葡萄 糖浓度，响应电流变化值逐渐减小，偏离线性。此阶段称为混合反应阶段，表现出来的是非一级反应，可依据Lineweaver-Burk公式[13]计算米氏常 数

将混合反应阶段葡萄糖浓度倒数及对应的电流倒数进行线性化拟合，继而计算得到米氏常数。从表1可知电极GOx/TNA-10、GOx/TNA-20、GOx/TNA-30、GOx/TNA-40的米氏常数分别是1.44、0.833、0.687、0.928 mmol·L-1，这可能与基底的纳米形貌相关，由于纳米受限作用，酶的空间构型可能发生改变，进而改变固定化GOx的米氏常数[26]。在生物化学上，米氏常数越小，固定化的TNA的生物活性越好，与反应物的亲和力越强，越有利于生物传感器性能，由表1可知这4种孔径的葡萄糖传感器米氏常数均非常小，因此这些固定化的GOx都具有良好的生物活性[13]。

从化学反应工程角度看，电化学葡萄糖氧化酶传感器发生如式（3）和式（4）的电极酶催化反应。在低葡萄糖浓度的情况下，即在线性化区间内，灵敏度与米氏常数关系如式（6）所示[30]。由式（6）可以看出，电极灵敏度与和这两个变量有关，米氏常数越小则灵敏度越高，从表1可知GOx/TNA-30的米氏常数最小，因此葡萄糖传感器灵敏度性能最高。另外，随着孔径的增加，反应物的扩散系数先增加，后增加速率减慢，最后与主体溶液中的扩散系数相同[21-22]，而与扩散系数相关，扩散系数越大则越大，越有利于葡萄糖传感器灵敏度。

综上，在米氏常数和扩散系数的共同作用下，电极GOx/TNA-30远大于GOx/TNA-40、GOx/TNA-20和GOx/TNA-10。表1给出了实验测定的灵敏度大小，从表中可知这个实验结果与理论推导结果相符。

表1 米氏常数对葡萄糖传感器灵敏度性能的影响

另外溶液扩散阻抗也是影响电化学葡萄糖传感器的重要因素。从传递阻抗可知，电极反应要经过外扩散、内扩散过程，而葡萄糖传感器反应的外扩散阻力通过搅拌去除，只剩下内扩散阻抗因素。孔径越大，则溶液扩散系数越大，根据式（7）[31]可知扩散阻抗与扩散系数相关，扩散系数越大则扩散阻抗越小。图6是电极的交流阻抗信息，交流阻抗谱反映出电子传递阻抗和溶液扩散阻抗，线性部分反映出的是溶液扩散阻抗[32-33]。图中显示，电极GOx/TNA-10、GOx/TNA-20、GOx/TNA-30、GOx/TNA-40的交流阻抗谱都是线性关系。通过图6中的模拟电路估算出对应的扩散阻抗值，分别是1.608×10-3、1.124×10-3、1.093×10-3、6.21×10-4Ω·cm-2，扩散阻抗逐渐减小，而较小的阻抗有利于传感器性能的提高，由表1可知孔径为83 nm和102 nm的电极灵敏度都大于另外两个小孔径电极。

2.3.3 抗干扰测试 图7是GOx/TNA葡萄糖传感电极的抗干扰实验结果，采用计时电流法测定，在PBS缓冲液中依次加入如下溶液：a—0.5 mmol·L-1葡萄糖溶液；b—0.5 mmol·L-1抗坏血酸溶液；c—0.5 mmol·L-1多巴胺溶液；d—0.5 mmol·L-1乙酸；e—0.5 mmol·L-1葡萄糖溶液。由图7可知，GOx/TNA传感电极对干扰物响应甚微，与加入葡萄糖溶液相比干扰信号均小于5%，说明这种电极具有很强的抗干扰性能。

图7 干扰物对葡萄糖测定的影响

3 结 论

采用阳极氧化法，以乙二醇为溶剂、氟化铵为腐蚀剂，控制水质量分数在1%，制备出高结晶度、高度规整孔结构的TNA，通过调节阳极氧化电压定向调控TNA的孔径，通过调控GOx/TNA电极的孔径调节溶液扩散阻抗和米氏常数的大小。研究发现，在孔径为20～102 nm范围内，当孔径为83 nm时，电极的扩散阻抗相对较小，米氏常数达到最小0.687 mmol·L-1，因此葡萄糖传感器灵敏度最高达到27.2 μA·(mmol·L-1)-1·cm-2。综上所述，通过调节纳米材料的孔径可改变固定化酶的活性，从而显著提高传感器的灵敏度性能。

符 号 说 明

c——葡萄糖浓度，mmol·L-1 cs——反应物在界面上的浓度，mmol·L-1 Δc——主体溶液中每次增加的反应物浓度，0.1 mmol·L-1 Δcs——主体溶液反应物增加引起的界面上反应物浓度的变化量，mmol·L-1 D——反应物扩散系数，m2·s-1 F——法拉第常数，C·mol-1 IF——稳态电流，μA imax——饱和电流，μA iss——稳态电流，μA ——米氏常数，mmol·L-1 L——有效扩散层长度，m n——电极反应中电子转移数 R——溶液扩散阻抗，Ω·m-2 Rt——极化电阻，Ω·m-2 rmax——固定化酶的最大反应速率，mol·g-1·s-1 S——葡萄糖传感器灵敏度，μA·(mmol·L-1)-1·cm-2 γ——反应级数

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Regulate properties of glucose oxidase biosensors through pore sizes of TiO2nanotube arrays

RAO Chao1, DONG Yihui1, ZHUANG Wei2, WU Xinbing1, HONG Qiliang1, LIU Chang1, LU Xiaohua1

(1State Key Laboratory of Materials-oriented Chemical Engineering, Nanjing Tech University, Nanjing 210009,Jiangsu, China;2National Engineering Technique Research Center for Biotechnology,Nanjing Tech University, Nanjing 211816,Jiangsu,China)

Highly ordered TiO2nanotube arrays (TNA) with controlled pore sizes in a series of 21, 62, 83 and 102 nm were synthesized using constant current oxidization method. Glucose oxidases (GOx) were immobilized on TNA by physical adsorption, and the GOx activities on TNA were investigated by cyclic voltammetry, chronoamperometry and electrochemical impedance spectroscopy. All immobilized GOx had good oxidizing activities in glucose solution and GOx on 83 nm-pore-sized TNA showed the best sensibility of 27.2 μA·(mmol·L-1)-1·cm-2, which was probably due to a combination effect of reduced diffusion resistance and small Michaelis constant of the immobilized GOx. The experimental results had demonstrated that controlling pore sizes of TNA could effectively tune sensitivity of glucose biosensors.

glucose oxidase; TiO2nanotube arrays; pore size; diffusion resistance; electrochemistry; biosensor; preparation; bioprocess

2016-02-19.

Prof. LIU Chang, changliu@njtech.edu.cn

10.11949/j.issn.0438-1157.20160181

O 647.32；TB 383

A

0438—1157（2016）10—4324—10

国家重点基础研究发展计划项目（2013CB733501）；国家自然科学基金项目（21136004，21476106，21506090）；江苏省自然科学基金项目（BK20130929）；江苏高校优势学科建设工程项目。

2016-02-19收到初稿，2016-05-06收到修改稿。

联系人：刘畅。第一作者：饶超（1989—），男，硕士研究生。

supported by the National Basic Research Program of China (2013CB733501), the National Natural Science Foundation of China (21136004, 21476106, 21506090), the Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20130929) and the Project of Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).