沉默肝星状细胞神经菌毛素-1抑制肝癌生长的实验研究

徐之超，陈　晨，慎浩鑫，马　丽，李文智，王　林，耿智敏

(西安交通大学第一附属医院：1.急诊科；2.肝胆外科，陕西西安　710061)



◇基础研究◇

沉默肝星状细胞神经菌毛素-1抑制肝癌生长的实验研究

徐之超1，陈晨2，慎浩鑫2，马丽2，李文智2，王林2，耿智敏2

(西安交通大学第一附属医院：1.急诊科；2.肝胆外科，陕西西安710061)

目的探讨沉默肝星状细胞神经菌毛素-1(neuropilin-1,NRP-1)表达后，是否会影响其对肝癌的促生长作用，并初步探讨可能存在的作用机制。方法细胞免疫荧光及细胞荧光双重染色观察NRP-1在肝星状细胞LX2中的表达及其与血小板源性生长因子受体β(platelet-derivedgrowthfactorreceptor-β,PDGFR-β)的共表达；MTT法检测沉默肝星状细胞NRP-1后对肝癌细胞体外增殖能力影响；建立裸鼠皮下肝癌移植瘤模型，绘制生长曲线，免疫组化法观察各组瘤体α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)、NRP-1、PDGFR-β表达强度的差异。结果LX2表面存在NRP-1表达，且NRP-1与PDGFR-β共表达于LX2；沉默LX2NRP-1后对HepG2促增殖作用降低(P<0.05)；NRP-1KG移植瘤体积较NRP-1CG、NRP-1NG小(P<0.05)，进一步对各组瘤体行免疫组化染色并进行表达强度积分分析，发现NRP-1KG瘤体间质NRP-1、PDGFR-β表达均较NRP-1CG弱(χ2=25.89，P<0.05；χ2=28.12，P<0.05)。结论沉默肝星状细胞NRP-1表达后，其对肝癌细胞促增殖作用降低，在体内环境中其对肝癌皮下移植瘤促生长作用也降低，其机制与肝星状细胞活化减弱有关，而肝星状细胞NRP-1表面共受体PDGFR-β表达减弱也可能参与这一过程。

神经菌毛素-1；肝星状细胞；肝癌；肿瘤微环境

肝癌微环境中除了肝癌细胞(hepatocellularcarcinomacells,HCCs)，还包括多种间质细胞及细胞外基质成分，这些间质成分一定程度上决定肿瘤的发生发展。肝星状细胞(hepaticstellatecells,HSCs)作为肝癌微环境主要间质细胞之一，在血小板源性生长因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF)等细胞因子作用下，转化为活化的HSC，自身增殖能力增强，进而促进肝癌发生发展[1-2]。同时，活化的HSC自分泌PDGF能力增强，反过来又可促进自身活化。神经菌毛素-1(neuropilin-1,NRP-1)是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，表达于多种细胞，可促进大多数肿瘤的发生发展。已有研究证实，沉默HCCNRP-1表达可抑制其增殖能力[3]。我们前期研究证实，NRP-1可通过促进HSCs活化来增强HCC增殖、迁移及侵袭能力[4]。那么沉默HSCsNRP-1表达，体内外环境下其对HCC促增殖作用是否会降低，目前还未见研究报道。本研究在观察HSCsNRP-1表达及NRP-1与PDGFR-β共表达的基础上，探讨沉默HSCsNRP-1表达对肝癌生长的影响，并进一步分析可能存在的作用机制。

1　材料与方法

1.1主要试剂DMEM、新生胎牛血清、胰酶购自美国Gibco公司；噻唑蓝(MTT)试剂、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司；抗Neuropilin-1兔抗人抗体、抗α-SMA兔抗人抗体、抗PDGFR-β兔抗人抗体、抗PDGFR-β猴抗人抗体、羊抗兔二抗、羊抗兔荧光二抗、羊抗猴荧光二抗购自美国Abcam公司。

1.2细胞系及裸鼠人肝癌细胞系HepG2由西安交通大学医学部中心实验室提供，人肝星状细胞系LX2购自中南大学湘雅中心实验室。上述两种细胞均以含100mL/L新生胎牛血清的DMEM培养，置于50mL/LCO2、37 ℃培养箱中培养。4周龄BALB/C裸鼠，SPF级别，雌雄各半，平均体质量(20±5)g，由西安交通大学医学部动物实验中心提供。动物实验在西安交通大学医学部动物实验中心完成。经西安交通大学医学部伦理委员会同意。

1.3方法

1.3.1细胞免疫荧光及激光共聚焦取5×103/mL密度肝星状细胞500μL接种于24孔板，培养24h后PBS清洗，多聚甲醛固定，再漂洗，封闭,加入一抗(兔抗人NRP-1，羊抗人PDGFR-β)，孵育2h后加入二抗(避光条件下操作)，漂洗，加入DAPI后再加入封片剂并迅速在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。

1.3.2慢病毒转染及Westernblot检测NRP-1蛋白表达应用前期已构建的慢病毒pGCSIL-RFPshNRP1[5]。接种5×103个LX2细胞于96孔培养板中，24h后按照设定感染复数加入稀释的病毒液及5μg/mLpolybrene，其中转染慢病毒空载体LX2为NRP-1CG(NRP-1controlgroup)，转染siRNA慢病毒的LX2为NRP-1KG(NRP-1knockdowngroup)，未转染慢病毒载体的LX2为NRP-1NG(NRP-1normalgroup)，72h后观察感染效果。转染并培养一定量后提取蛋白，应用Westernblot检测NRP-1蛋白表达，以β-actin作为内参，采用ECLTMWesternblot分析系统显影。

1.3.3MTT法检测细胞增殖将HepG2细胞以1×105/mL密度(无血清培养基稀释)取100μL分别接种于3张96孔板(包含调零孔和对照孔)，分别加入不同组LX2无血清上清液(离心后收集)，未加LX2上清液HepG2组为HCCG；于24、48、72h三个时间点各取一张96孔板加入新鲜配置的MTT溶液，继续培养4h并弃上清液后加DMSO摇床振荡，20min后在酶联免疫检测仪选择490nm波长下测定各孔的吸光度值。

1.3.4裸鼠肝癌皮下移植瘤的建立将24只裸鼠随机分组为NRP-1KG(NRP-1KG组肝星状细胞与肝癌细胞混悬液)、NRP-1CG(NRP-1CG组肝星状细胞与肝癌细胞混悬液)、NRP-1NG(NRP-1NG组肝星状细胞与肝癌细胞混悬液)及HCCG组(单纯注射肝癌细胞悬液)。分别于裸鼠腋窝皮下注射LX2(2×105)与HepG2(1×106)细胞混悬液或HepG2(1×106)，建立皮下移植瘤模型。注射后第7日开始，每隔1周测量4组中每只裸鼠移植肿瘤长径及与短径，计算其体积(V=长径×短径×短径/2)及平均体积。4周后取材。

1.3.5免疫组化观察裸鼠瘤体NRP-1与PDGFR-β表达不同瘤体组织标本经固定、脱水、透明、包埋后制成厚度为5μm切片。再经脱蜡、水化、漂洗，依次孵育NRP-1单克隆抗体(1∶100)或者PDGFR-β(1∶50)、二抗，DAB显色，苏木素复染，以PBS代替一抗作为阴性对照，阳性对照为已知Neuropilin-1或PDGFR-β，最后于显微镜下观察。阳性表达呈现棕黄色。结果判定标准：每张切片选取5个高倍镜视野，对每个视野下阳性细胞百分比和着色强度进行计分。着色强度计分：细胞无着色为0分；浅黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分；阳性细胞百分比，0分为百分比为0，1分为0～25%，2分为26%～50%，3分为51%～75%，4分为>75%。上述计分结果相加，0分为阴性(-)，1～3分为弱阳性(+)，4～5分为中等阳性()，6～7分为强阳性()。

1.4统计学处理所有数据统计均采用SPSS13.0统计软件进行分析处理。对两组或多组计量资料采用独立样本的t检验，多组数据间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1NRP-1在LX2中的表达及其与PDGFR-β在LX2中共表达情况NRP-1表达于多种细胞表面，应用细胞免疫荧光检测可观察到LX2细胞表面NRP-1表达，主要表达于细胞膜。细胞荧光双重染色可观察到PDGFR-β在LX2也有表达，且两者共表达于LX2细胞膜(图1)。

图1NRP-1在LX2中的表达及其与PDGFR-β的共表达

Fig.1ExpressionofNRP-1andco-expressionwithPDGFR-βinhepaticstellatecells

A：红色荧光表示NRP-1表达(×200)；B：绿色荧光表示PDGFR-β表达(×200)；Merge：黄色荧光表示NRP-1与PDGFR-β共表达(×400)

2.2慢病毒转染LX2感染复数复核及NRP-1蛋白的表达当MOI=30时LX2感染细胞数基本达到80%以上，可以将30确定为慢病毒感染LX2的感染复数，进行后续实验。按照MOI为30感染LX2，对NRP-1KG、NRP-1CG、NRP-1NGLX2应用Westernblot检测NRP-1表达，结果显示NRP-1KG组NRP-1表达降低(图2，P<0.05)，证实了我们构建的慢病毒载体NRP-1shRNA可以有效沉默LX2NRP-1表达。

图2Westernblot检测NRP-1KG、NRP-1CG、NRP-1NGLX2细胞NRP-1的表达

Fig.2LX2NRP-1expressionofNRP-1KG,NRP-1CG,andNRP-1NGdetectedbyWesternblot

2.3ShRNA干扰LX2NRP-1表达后对HepG2增殖能力的影响为了检测沉默LX2NRP-1后对HepG2增殖能力影响，对NRP-1KG、NRP-1CG、NRP-1NG及HCCG各组应用MTT法分别检测不同时间点(24、48、72h)的吸光度(A值)变化。结果显示，NRP-1KG吸光值较NRP-1CG低，NRP-1NG吸光值较HCCG组高(图3，P<0.05)。说明LX2可以促进HepG2的增殖能力，而沉默LX2NRP-1表达后，其对HepG2的促增殖作用减弱。

图3HepG2不同组吸光值柱状图

Fig.3AvalueofNRP-1indifferentgroups*P<0.05。

2.4裸鼠皮下移植瘤的生长情况裸鼠肝癌皮下移植瘤模型建立后，从注射后第7天开始，每周测量4组中各只裸鼠移植肿瘤长径及与短径，28d后处死裸鼠，计算每周瘤体体积并绘制生长曲线(图4)。统计结果显示，NRP-1KG组瘤体体积较NRP-1CG和NRP-1NG组小(P<0.05)，HCCG组瘤体体积小于NRP-1CG与NRP-1NG组(P<0.05)，表明在体内环境下LX2可促进HepG2增殖，而沉默NRP-1LX2对HepG2促增殖作用降低。

2.5皮下移植瘤小动物的成像情况对NRP-1KG、NRP-1CG两组裸鼠处死前进行小动物成像，两组随机选取面积及背景相同区域，得到荧光强度值总和。结果显示，两组肿瘤组织内荧光强度不同(图5)，相同区域内NRP-1KG荧光值低于NRP-1CG荧光强度(P<0.05)，说明NRP-1KG瘤体中LX2数目低于NRP-1CG。

图4裸鼠皮下移植瘤的生长情况

Fig.4Growthofsubcutaneouslytransplantedtumorinnudemice

A：不同组裸鼠皮下成瘤；B：不同组移植瘤瘤体；C：不同组裸鼠瘤体生长曲线。黑箭头为移植瘤瘤体，*P<0.05。

图5裸鼠成像图及两组荧光强度的比较

Fig.5Nudemiceimagingandcomparisonoffluorescenceintensityinthetwogroups

A、B：NRP-1KG；C、D：NRP-1CG。*P<0.05。

2.6移植瘤体免疫组化检测结果NRP-1KG、NRP-1CG、NRP-1NG各组HE染色可见肿瘤间质较多，并分隔、包绕肿瘤组织形成多个肿瘤结节，结节中心有时可以看到坏死的肿瘤组织，周边为未坏死的肿瘤组织，NRP-1KG较多见。各组瘤体α-SMA染色后可见不同组别之间α-SMA表达情况不同(图6)。为进一步比较不同组间质中NRP-1与PDGFR-β表达情况，各组染色后分别进行人工计数排除肝癌细胞和血管内皮细胞表达。统计结果显示，NRP-1KG组间质细胞NRP-1与PDGFR-β表达低于NRP-1CG组(P<0.05，图7、图8、表1、表2)。

图6各组α-SMA的免疫组化染色

Fig.6α-SMAexpressionindifferentgroupsbyimmunohistochemistry(DAB, ×200)

A：NRP-1KG组；B：NRP-1CG组；C：NRP-1NG组；D：HCCG。

3　讨　　论

NRP-1作为多种细胞因子共受体，可促进细胞因子与其受体结合，放大下游信号传导，参与血管形成、肿瘤生长、免疫调节等过程[6-8]。既往多项研究已证实，HSCs在体内外环境下可促进肝癌生长，并可将HSCs作为肝癌靶向治疗靶标及评估肝癌患者预后指标之一[9]。目前关于HSCs促HCC增殖相关机制的研究较多，如HSCs促进FAK-MMP9信号传导[10]，分泌TGF、PDGF、VEGF、MMP-2、MMP-9[11-12]，促进骨桥蛋白形成[13]，参与肝癌细胞耐药性产生[14]等多种不同机制。除上述机制，HSCs还可以通过促进肝癌细胞发生免疫逃逸和肝癌细胞上皮细胞间质化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)间接促进肝癌发展[15-17]。我们体内及体外实验证实，HSCs促进HCC增殖及肝癌生长同时，也发现沉默HSCsNRP-1表达，其对HCC促增殖作用降低，这提示我们HSCsNRP-1基因可以考虑作为肝癌靶向治疗的靶点之一。而关于沉默HSCsNRP-1表达后，通过何种机制影响肝癌生长，目前还未见相关报道。我们推测，这一作用机制可能是通过影响HSCs活化状态、细胞外基质分泌及细胞表面部分受体表达改变，进一步影响肝癌细胞内相关促增殖信号传导。由于HSCs活化的重要标志是α-SMA表达，α-SMA表达强度越弱，HSCs活化程度越弱，对肝癌间接促生长作用也降低。随后，我们对各组瘤体进行α-SMA免疫组化染色可观察到各组均有表达，但表达范围及强度不同，尤其是NRP-1KG与NRP-1CG两组。HCCG瘤体内仅有少量表达或不表达α-SMA。这说明沉默LX2NRP-1表达后对肝癌促生长作用降低的机制之一是LX2活化状态发生改变，当然这也需要后期Westernblot进一步验证。

图7各组NRP-1的免疫组化染色

Fig.7NRP-1expressionindifferentgroupsbyimmunohistochemistry(DAB, ×200)

A：NRP-1KG组；B：NRP-1CG组；C：NRP-1NG组；D：HCCG组。

图8各组PDGFR-β的免疫组化染色

Fig.8PDGFR-βexpressionindifferentgroupsbyimmunohistochemistry(DAB, ×200)

A：NRP-1KG组；B：NRP-1CG组；C：NRP-1NG组；D：HCCG组。

表1两组间质细胞NRP-1表达的人工计数结果分析

Tab.1ArtificialcountinganalysisofNRP-1expressioninmesenchymalcellsinthetwogroups

NRP-1表达NRP-1KG(个/视野)NRP-1CG(个/视野)总和χ2值P值-303+2110316162204425.89<0.001

表2两组间质细胞中PDGFR-β表达的人工计数结果分析

Tab.2ArtificialcountinganalysisofPDGFR-βexpressioninmesenchymalcellsinthetwogroups

PDGFR-β表达NRP-1KG(个/视野)NRP-1CG(个/视野)总和χ2值P值-527+204245182306628.12<0.001

研究中我们对NRP-1KG与NRP-1CG两组裸鼠处死前进行小动物成像，取相同大小及背景统计后发现两组荧光强度不同，提示在体内环境下沉默HSCsNRP-1表达后，HSCs自身增殖能力减弱。由于HCC与HSCs之间对话是相互的，HSCs可以促进HCC增殖，反过来HCC也可以促进HSCs的活化增殖[18]。因此，NRP-1KGHSCs数目相对较少也需要考虑由于肝癌实质细胞对沉默NRP-1表达后的HSCs促增殖能力减弱有关，但后者作用相对较弱。

体外研究可观察到LX2细胞表面NRP-1与PDGFR-β共定位表达，体内研究中两者在NRP-1KG、NRP-1CG及NRP-1NG瘤体肝癌实质高表达，而在间质中NRP-1KG表达比例较低，NRP-1CG及NRP-1NG间质中表达比例较高。在HCCG除了肝癌实质较高表达外，间质几乎没有表达或少量表达NRP-1与PDGFR-β。NRP-1KG可见少量NRP-1表达，主要是由于对LX2转染效率并非100%及部分LX2转染后NRP-1未被完全有效沉默。同样，PDGFR-β在肝癌细胞均呈现高表达，在各组间质细胞中NRP-1KG间质中表达比例较低，NRP-1CG及NRP-1NG间质中PDGFR-β表达比例较高，这与CAO等[19]证实HSCs中NRP-1的高表达与PDGFR-β高表达具有相关性的结论一致。而PDGFR-β高表达是否会影响肝癌细胞增殖，目前也同样未见相关报道，但PDGFR-β高表达是会影响HSCs自身活化过程，这也会间接影响肝癌细胞增殖。

理想的分子靶向治疗是仅作用于肿瘤细胞本身，而由于在大多数肿瘤微环境中其他细胞也会表达肿瘤相关蛋白，那么了解目的基因蛋白在肿瘤微环境中所发挥的作用显得尤为重要。本研究证实了沉默HSCsNRP-1表达会抑制肝癌细胞增殖，那么以NRP-1为靶点的分子治疗不仅会抑制肝癌本身，也会抑制肝癌微环境中相关促癌成分，这为后期进一步探究肝癌靶向治疗靶点提供了方向和思路。

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(编辑卓选鹏)

Silencingneuropilin-1expressionofhepaticstellatecellsinhibitsthegrowthofhepatocellularcarcinoma

XUZhi-chao1,CHENChen2,SHENHao-xin2,MALi2,LIWen-zhi2,WANGLin2,GENGZhi-min2

(1.EmergencyDepartment; 2.DepartmentofHepatobiliarySurgery,theFirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China)

ObjectiveToinvestigatewhethertheexpressionofhepaticstellatecellsneuropilin-1silenced(NRP-1)affectsthegrowthofhepatocellularcarcinomacells(HCCs)andtoexplorethepossiblemechanism.MethodsExpressionofNRP-1andco-expressionwithplatelet-derivedgrowthfactorreceptor-β(PDGFR-β)inhepaticstellatecellswereobservedbyimmunofluorescenceandfluorescentdoublestaining.TheeffectofsilencingNRP-1ofHSCsontheproliferationofHCCcellswasdetectedbyMTTin vitro.Axenografthepatocellularcarcinomamodelofnudemousewasestablishedsubcutaneously.Thegrowthcurvewasdrawnandtheexpressionsofα-SMA,NRP-1andPDGFR-βintumorswereobservedbyimmunohistochemistrystainingafterthemicewerekilled.ResultsNRP-1wasexpressedinthemembraneofLX2andwasco-expressedwithPDGFR-β.SilencingNRP-1ofLX2reducedtheproliferationofHepG2 in vitro (P<0.05).ThetumorvolumeinNRP-1KGgroupreducedobviouslycomparedwiththatinNRP-1CGgroup(P<0.05).TheexpressionsofNRP-1andPDGFR-βinNRP-1KGgroupwereweakerthanthoseinNRP-1CGgroupbyimmunohistochemistry(χ2=25.89, P<0.05; χ2=28.12, P<0.05).ConclusionSilencingNRP-1expressionofHSCscandecreaseitseffectontheproliferationofHCCsin vitroandthegrowth-promotingeffectofHSCsonHCCsisalsodecreasedin vivo,whichisduetotheinhibitionofHSCsactivation,andthedecreasedexpressionofco-receptorPDGFR-βmayplayaroleinthisprocess.

neuropilin-1;hepaticstellatecell;hepatocellularcarcinoma;tumormicroenvironment

2015-06-05

2016-04-29

国家自然科学基金资助项目(No.30971340)

耿智敏.E-mail:gengzhimin@mail.xjtu.edu.cn

R735.7

A

10.7652/jdyxb201605007

SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.30971340)

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160802.1150.010.html(2016-08-02)