兔自体骨膜包裹肌腱移植前交叉韧带重建实验研究

崔巍 时剑辉 刘振中 王岩 曲颖 吕伟

兔自体骨膜包裹肌腱移植前交叉韧带重建实验研究

崔巍 时剑辉 刘振中 王岩 曲颖 吕伟

目的 观察比较翻转骨膜包裹自体肌腱移植、单纯自体肌腱及骨膜正常包裹自体肌腱移植，重建前交叉韧带移植物腱骨愈合的组织学变化过程。方法 取60只新西兰白兔120膝，随机平均分为翻转骨膜组、正常骨膜组及肌腱组。切除兔双膝前交叉韧带，取其双侧拇长伸肌腱，及需要切取骨膜侧胫骨上端内侧骨膜，大小约1.5 cm×0.5 cm。同侧肌腱折成2股重建兔双膝前交叉韧带。采用HE染色、甲苯胺蓝染色，观察重建术后3、4、8及12周时移植物腱骨愈合的变化情况。结果显微镜下观察重建术后随着时间推移，翻转骨膜组较其他两组腱骨界面可见成纤维细胞、纤维软骨细胞更多表达；12周时，翻转骨膜组腱骨界面间的胶原纤维数量及排列较其他两组无明显差异；生物力学测试术后3、4、8周骨膜翻转组抗牵拉力明显大于其他两组，而术后12周组间对照无统计学差异。结论 骨膜包裹自体肌腱移植重建兔前交叉韧能够在愈合期12周内促进腱骨结合部成纤维细胞、骨细胞及软骨细胞的再生；对腱骨愈合具有积极的促进作用，超过愈合期则无差异。

兔；骨膜；前交叉韧带；自体肌腱；移植

前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）是膝关节中重要的稳定结构之一，具有重要的生理功能[1］。韧带损伤如果通过MRI、X 线等[2］诊断后，应尽早行手术治疗[3］。关节镜下自体肌腱移植重建ACL已经成为主要治疗方法之一。但重建术后移植物松动失败也占有相当比例[4］。纠其原因有很多，其中腱骨愈合速度与程度是决定手术效果的重要因素[5-6］。本实验的目的是观察翻转骨膜包裹自体肌腱移植重建ACL，移植物腱骨愈合的组织学变化过程，旨在为临床应用此方法提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

健康新西兰白兔60只，5月龄，体重3.0 kg左右，由哈尔滨医科大学动物实验中学提供。

1.2 实验方法和步骤

1.2.1 分组 将60只白兔随机分成：A骨膜翻转缝合组（生发层面向骨道）；B骨膜正常缝合组（生发层面向肌腱）；C无骨膜包裹。

1.2.2 手术方法 应用20%氨基甲酸乙酯5 ml/kg耳缘静脉注射麻醉，双膝关节脱毛后消毒，于胫骨近端内侧切取1.5 cm×0.5 cm骨膜备用，分别在同侧足背切口，游离拇长伸肌并切取，A组以0#尼龙线进行股骨侧，骨膜翻转包裹后的2股肌腱编织缝合固定。以3.0钻头钻通胫骨、股骨骨隧道，分别于骨道外口附近外固定一枚螺钉，以备栓桩。将制备好肌腱由引导线引入骨道内，并将两侧编织缝合线固定在螺钉处。打紧线结使移植物处于最佳位置。B组为股骨侧骨膜不翻转缝合；C组无骨膜包裹，其他手术方法同上。术后自由活动，常规应用抗生素，观察创口。实验过程中白兔膝关节无感染发生，无白兔死亡。于3、4、8、12周随机处死15只（每组5只），随机选取6只12膝（每组2只）进行显微镜下观察，随机选取9只18膝（每组3只）进行生物力学测试。

表1 各个组别不同时期生物力学测试及统计学检验结果[（±s），n=18］

表1 各个组别不同时期生物力学测试及统计学检验结果[（±s），n=18］

注：术后3、4、8周A组与B、C组间比较P＜0.05，术后12周组间比较P＞0.05

A B C P 3周（n=18） 51.27±1.36 29.68±2.21 27.44±2.68 0.000 5 4周（n=18） 69.22±6.54 52.81±3.83 50.77±5.59 0.000 1 8周（n=18） 104.27±4.84 80.66±4.62 78.33±6.12 0.000 1 12周（n=18） 126.35±5.44 120.63±4.45 118.83±5.64 0.06

1.3 观测方法

1.3.1 显微镜观察 给予标本固定，常规处理切片，HE染色后进行组织学观察。

1.3.2 生物力学测试 三组实验对象分别于3、4、8、12周时取材，拆除股骨侧固定钉处的尼龙线，保留胫骨固定方式，切断除重建的前交叉韧带外的股骨和胫骨之间的软组织，将标本固定在WDW-100微机控制电子万能生物力学试验机，加以5 mm/s的速度将肌腱从股骨隧道内拉出，并记录腱骨分离时最大拉力载荷。

1.4 统计学处理

使用SPSS 17.0统计学软件包进行数据检验，所有指标数据用（±s）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 显微镜观察

术后3周：A组：骨膜内有大量间充质细胞增生，并可见新生骨样组织形成。腱骨结合部有大量细胞浸润，主要为炎性细胞，其次为成纤维细胞，并出现少量纤维软骨细胞，骨膜生发层部位还可见大量新生软骨细胞，排列不规整。B组：骨膜增生，骨膜内可见部分新生软骨细胞和基质，部分软骨钙化成骨。C组：腱骨界面通过大量胶原纤维连接，未见新生软骨细胞及基质。

术后4周：A组：出现明显的膜内化骨，在骨界面也可以看到胶原和结缔组织为主要成分的新生骨质，并向肌腱内长入，新生骨小梁周围可见大量骨母细胞呈栅形排列。B组：骨膜部位可见较多的软骨细胞，腱骨接点处纤维结缔组织增生，胶原排列尚紊乱，骨面见少量新生骨质。C组：腱骨界面间无新生骨形成，仅通过大量成纤维细胞及胶原纤维相连。

术后8周：A组：新生骨小梁与肌腱和骨隧道结合紧密，无间隙，排列比较规整，胶原纤维成束状于钙化组织交错排列，沿力线方向有规律排列，趋于正常腱骨附着结构。B组：腱骨界面间可见新生骨骨岛以及大量软骨细胞，排列略规则，胶原纤维成束状于钙化组织交错排列，沿力线方向较有规律排列。C组：腱骨界面间通过胶原纤维相连，排列紊乱，局部可见少量软骨细胞及软骨钙化。

术后12周：A、B、C各组镜下见新生骨小梁与肌骨隧道结合紧密，无间隙，排列规整，为正常腱骨附着结构。

2.2 生物力学测试结果

3、4、8周各组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），12周各组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。可见骨膜翻转包裹肌腱在腱骨愈合的时间内无论是抗牵拉力还是腱骨结合强度都大于其他方式肌腱移植。

3 讨论

3.1 腱骨结合处解剖学特点

腱骨之间的结合方式有两种：（1）间接止点，由致密纤维结缔组织构成，是动物模型中常见的愈合方式，特征为腱骨连接处由走向与骨道纵轴垂直的穿插性Sharpey纤维构成[7］。这些纤维是由Ⅲ型胶原组成，因其连接骨与肌腱，因此被看做是腱骨愈合的最早标志。（2）直接止点是由纤维结缔组织、纤维软骨、矿化的纤维软骨及骨组织组成。是生理状态下肌腱止点，也可见于愈合后腱骨连接部[8］。

3.2 影响腱骨愈合的因素

正常移植肌腱与骨愈合需经历移植物的变性、血管再生、细胞再生、胶原沉着和基质重塑的过程。如果移植物与宿主具有较好的组织相容性并与骨道紧密接触，就会很快地与骨道进行生长、结合，从而保证重建韧带的早期稳定性。董向辉[9］等研究证实关节滑液对前交叉韧带重建后韧带的强度以及腱骨愈合有不利影响。而固定位点选择不佳[10］、初期固定不牢固及过早、过度地进行康复训练等都是影响腱骨愈合的重要因素。

3.3 自体骨膜促进腱骨愈合的机制

骨膜是由大量未分化祖细胞和基质颗粒组成内层（生发层）和大量成纤维细胞和胶原纤维束组成的纤维层（外层）构成；生发层含有丰富的未分化的间充质干细胞，这些细胞因外界的环境不可而分化成成骨细胞和软骨细胞，目前已经有大量实验证明骨膜能够促进骨和软骨的愈合。左百军等[11］利用骨膜包裹自体跟腱重建兔ACL，发现能促进腱骨界面的炎性反应发生和细胞聚集以及成纤维细胞、骨细胞及软骨细胞的再生，促进新生毛细血管的形成及软骨分化，从而促进腱骨愈合。

本课题研究将骨膜翻转后包裹肌腱缝合植入腱骨交接处，其生发层朝向不同的方向，在显微镜下可明显观察到同一时间节点软骨成骨、新骨形成等有明显差异，A组成骨特征明显好于其他组别。这在腱骨愈合阶段有着非常重要的临床意义。而本研究的生物力学分析也可清的看到，翻转骨膜包裹后的A组在术后3、4、8周抗牵拉抗拔出力均好于其他两组。骨膜包裹后的肌腱移植可以明显提高愈合速度和愈合强度，可以减少因制动而产生的关节僵硬，提前进行康复练习，降低关节粘连的发生几率，提高患者满意度，减少社会医疗资源的浪费。而在本研究中也可看到术后12周腱骨愈合后虽然在组织学形态上还有区别，但在生物力学测试中的到的数据并未提示有统计学差异。关节液中存在的多种影响腱骨愈合的物质，而骨膜包裹肌腱后可以最大限度封堵关节液进入腱骨界面间，减少关节液的不利影响，同时也减少骨隧道的扩大，促进腱骨愈合。

[1]Fabio C，Ludovico C，Andrea F，et al. Knee stability after anterior cruciate ligament reconstruction in patients older than forty years: comparison between different age groups[J］. International orthopaedics，2013，37（11）：2265-2269.

[2]Bogunovic L，Yang JS，Wright RW. Anterior Cruciate Ligament Reconstruction: Contemporary Revision Options[J］. Operative Techniques in Sports Medicine，2013，21（1）：64-71.

[3]Muller B，Bowm an Jr KF，Bedi A. ACL graft healing and biologics[J］. Clinics in sports medicine，2013，32（1）：93-109.

[4]Cramer KE，Moed BR. Patellar Fraetures: Contemporary Appro-aeh to Treatment[J］. J Am Aead Orthop Surg.，1997，5（6）：323-331.

[5]陈百成，栾广，张展翅，等. 自体骨膜包裹肌腱对腱骨愈合的影响[J］. 中华骨科杂志，2006，26（2）：118-122.

[6]Karpie JC，Steiner ME. Anatomic Anterior Cruciate Ligament Reconstruction: An Anteromedial Approach without Hyperflexion[J］. Operative Techniques in Sports Medicine，2013，21（1）：27-33.

[7]Atesok K，Fu FH，Wolf MR，et al. Augmentation of tendon-tobone healing[J］. J Bone Joint Surg Am.，2014，96（6）：513-521.

[8]Rothrauff BB，Tuan RS. Cellular therapy in bone-tendon interface regeneration[J］. Organogenesis，2014，10（1）：13 -28.

[9]董向辉，凌鸣，冯伟楼，等. 关节滑液对兔前交叉韧带重建后腱骨愈合生物力学和组织学的影响[J］. 中国组织工程研究，2012，16（11）：1937-1940.

[10]Pascual-Garrido C，Swanson BL，Swanson KE. Transtibial versus low anteromedial portal drilling for anterior cruciate ligament reconstruction: a radiographic study of femoral tunnel position[J］. Knee Surgery Sports Traumatology Arthroscopy，2013，21（4）：846-850.

[11]李欢，高桂英，丁文鸽，等. 自体单束腘绳肌腱保残重建前交叉韧带的疗效[J］. 江苏医药，2014，40（3）：352-354.

Experimental Study on Anterior Cruciate Ligament Reconstruction with Autologous Periosteum Wrapped Tendon in Rabbits

CUI Wei SHI Jianhui LIU Zhenzhong WANG Yan QU Ying LV Wei Department of Orthopedics， Heilongjiang Hospital， Harbin Heilongjiang 150036， China

Objective To compare reverse periosteum w rapped autologous tendon transplantation， autologous tendon and normal periosteumw rapped with autologous tendon transplantation， reconstruction of anterior cruciate ligament graft tendon bone healing histological change. Methods 60 New Zealand white rabbits 120 knees were selected， the reversed periosteum group， the normal periosteum group and the tendon group. Resection of rabbit knee anterior cruciate ligament， the bilateral extensor pollicis longus tendon， and the need to cut the proximal tibia medial periosteal periosteum，the size of about 1.5 cm×0.5 cm. The same side of the tendon folded into 2 strands of anterior cruciate ligament reconstruction. Using HE staining，toluidine blue staining， observe the reconstruction after 3， 4， 8 and 12 weeks of shift plant tendon bone healing. Results Observation under the microscope after reconstruction with time reversal periosteum group than the other two groups of tendon bone interface fibroblasts， cartilage cells more expression， at 12 weeks， flip periosteum group tendon bone interface between the number and arrangement of the collagen fibers than the other two groups had no significant difference； biomechanical test after 3 and 4，8 week group of anti pulling force of periosteal turnover was significantly greater than the other two groups， and 12 weeks after operation there was no significant difference between groups. Conclusion Reconstruction of periosteumw rapped tendon autograft of rabbit anterior cruciate ligament can promote the regeneration of tendon bone healing in 12 weeks with fibroblasts， osteoblasts and chondrocytes； which plays a positive role in promoting the healing of tendon bone healing period， there were no differences over.

Rabbit， Periosteum， Anterior cruciate ligament， Autologous tendon， Transplantation

R 687

A

1674-9308（2016）26-0215-03

10.3969/j.issn.1674-9308.2016.26.140

黑龙江省医院骨科，黑龙江 哈尔滨 150036

吕伟，E-mail：cuiwei720409@sina.com