缺血预处理和后处理对兔移植肺缺血-再灌注损伤的保护作用的比较

魏　琴， 刘媛媛， 姜　涛， 马　嵋， 张　春， 伊力亚尔·夏合丁， 朱　辉

(1新疆医学动物模型研究重点实验室，新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院；新疆医科大学第一附属医院2次消毒供应室；3教学科； 4胸外科, 乌鲁木齐　830054)



缺血预处理和后处理对兔移植肺缺血-再灌注损伤的保护作用的比较

魏琴1， 刘媛媛2， 姜涛1， 马嵋3， 张春1， 伊力亚尔·夏合丁4， 朱辉4

(1新疆医学动物模型研究重点实验室，新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院；新疆医科大学第一附属医院2次消毒供应室；3教学科；4胸外科, 乌鲁木齐830054)

目的比较缺血预处理和缺血后处理2种方法对大白兔肺移植术中缺血-再灌注损伤的保护作用。方法对48只新西兰大白兔建立异体兔肺移植模型，随机等分为缺血再灌组(IR组)、缺血预处理组(IPC组)、缺血后处理组(IPOST组)。监测移植再灌注后60、120 min时氧分压(PaO2)的变化，观察各组动物肺组织的病理改变，检测血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量，计算肺湿/干重比(W/D)。结果成功制备新西兰大白兔肺移植模型，对缺血-再灌注损伤采用缺血预处理和后处理2种方法干预，病理结果显示，IPC组和IPOST组肺组织的损伤较轻，但IPC组损伤最轻；各组在不同时间点PaO2含量差异有统计学意义(P<0.05)。在60、120 min时，IPOST、IPC组PaO2高于IR组，IPOST组PaO2低于IPC组，差异有统计学意义(P<0.05)；3组SOD、MDA、NO、TNF-α及W/D差异有统计学意义(P<0.05)。与IR组比较，IPC组SOD、NO高于IR组，而MDA、TNF-α及W/D低于IR组，差异有统计学意义(P<0.05)，IPOST组SOD、NO低于IPC组，而MDA、TNF-α及W/D高于IPC组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论缺血预处理及缺血后处理对兔肺移植缺血-再灌注损伤均有保护作用，其中缺血预处理的效果最明显。

缺血预处理； 缺血后处理； 缺血再灌注损伤； 肺移植

缺血-再灌注损伤(IRI)在肺移植术中是导致移植失败的一个重要因素，在72 h内移植肺再灌注可引起肺水肿、弥漫性肺损伤、低氧血症等，严重会导致原发性移植物功能障碍[1-2]。缺血预处理(IPC)已经被证实在IRI中对心[3]、肝[4]、脑[5-6]、肾[7]等多器官有保护作用。已有研究证实缺血后处理(IPOST)能提高心肌、肝脏及肺脏等脏器对较长时间缺血的耐受性[8-10]。本研究制备新西兰大白兔肺移植模型，检测氧分压(PaO2)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量和肺湿/干重比(W/D)，探讨IPC和IPOST在缺血-再灌注损伤中的保护作用，为以后肺移植模型成功建立和降低IRI风险提供实验依据。

1　材料与方法

1.1实验动物及分组新西兰健康大白兔48只，2月龄，体质量3.0～3.5 kg，购自新疆医科大学实验动物中心[动物许可证号：SYXK(新)2013-0001]。动物实验在新疆医科大学第一附属医院实验动物科学研究部进行，该部门具有国际AAALAC资质认证，动物实验按照国际标准化操作流程执行。按随机数字表将实验动物随机均分为3组(n=16)，分为缺血再灌注(IR)组、缺血预处理(IPC)组、缺血后处理(IPOST)组，每组按体质量相近原则配对成供体和受体。

1.2肺移植动物模型制备

1.2.1供体手术供体麻醉和手术的步骤与方法参见文献[11]。麻醉：实验动物先给予异丙酚(0.3 mg/kg体质量)和万可松(0.2 mg/ kg体质量)进行麻醉诱导。气管插管，接容量控制呼吸机(HX-300，泰盟)，给氧浓度(FiO2)为100% ，双肺通气潮气量15 mL/kg体质量，呼吸频率30次/min。给予异丙酚(30 mg·kg· h-1)和万可松(0.2 mg·kg·h-1)静脉注入维持麻醉。供肺的灌注前准备：动物右侧卧位固定后，按照外科手术常规方式消毒铺巾，左侧第5肋间开胸后解剖分离上、下腔静脉和左肺动脉、静脉及左主支气管。静脉给予肝素钠(700 U/kg体质量)进行全身肝素化。灌注与保存：阻断上、下腔静脉回心血流，剪开胸腔动脉放血。经右心室插管以4℃的乳酸林格氏液顺行灌注(100 mL/kg体质量)。随后经左心房向肺静脉逆行灌注(50 mL/kg体质量)。整块切取左肺及左肺静脉汇入处心房壁，修剪整齐，置入4℃的乳酸林格氏液备用。

1.2.2受体手术麻醉及移植前准备麻醉及气管插管同供体，双肺通气潮气量15 mL/kg体质量，单肺通气潮气量10 mL/kg体质量,右侧卧位置于40℃保温毯上。开胸:解剖游离支气管及血管，血管夹阻断左肺动脉及支气管，2把主动脉侧壁钳夹肺静脉汇入处的左心房侧壁。切断血管、支气管及心房壁，切除左肺。供肺植入：供肺以4℃的乳酸林格氏液纱布包裹后放入塑料袋，置入受体左胸腔。先行支气管连续缝合的对端吻合。随后受体左心房修剪成心房袖与供肺心房壁做连续缝合。最后间断缝合吻合肺动脉并预留一针不打结。

1.2.3手术操作时间及缺血-再灌注时程的控制供肺移植前手术准备时间为(20±5) min。植入手术操作时间为50 min，从开始吻合到再灌注的时间均控制在60 min。肺缺血时间控制在120 min。以再灌注时间120 min设定为指标观察终点。

1.2.4造模成功标准模型建立成功的评判标准是再灌注120 min留取标本后，动物心脏及肢体血管搏动正常，剪开肺上、下静脉均有持续通畅血流则模型判定为成功。

1.3不同组处理方法 IR组:实施异体肺移植但不做其他处理。IPC组：在供体肺灌注前，反复阻断与开放左肺动脉血流3次，阻断时间5 min，间隔时间5 min。IPOST组：受体肺移植操作完成后，先反复开放和阻断肺动脉血流5次，每次阻断与间隔时间为1 min，完全恢复植入肺的血流灌注。

1.4标本采集所有新西兰兔分别于受体肺切除(0 min)及移植再灌注后60、120 min 3个时点经左肺下静脉采血检测血氧分压(PaO2)。再灌注完后抽取左下肺静脉血用于检测SOD、MDA、NO和TNF-α。组织取左肺舌段部分约0.5 g称湿重，干燥箱100℃烘干24 h，称其干重，计算W/D，另取肺组织置于10%中性甲醛液固定，用于病理学检测。

1.5组织病理学检查固定于10%甲醛的肺组织经石蜡包埋，脱水，切片机(Leica,德国)切片厚3 μm，进行苏木素-伊红染色。组织形态由经验丰富的病理专家采图并评估。

2　结果

2.1动物模型造模情况本研究共用新西兰兔48只，供、受体分别24只，在供体手术中无死亡及麻醉意外，受体手术死亡3只，成功21只。

2.2肺组织病理改变IR组：镜下可见肺泡腔大小不等、结构紊乱、部分肺泡壁断裂，呈现气肿状，肺泡内可见大量出血、水肿,肺泡部分不张(图1a)。IPC组：镜下肺泡结构不完整，部分肺泡壁断裂，肺泡腔清晰，水肿及气肿较轻，炎症改变相对较轻(图1b)。IPOST: 镜下肺泡结构不完整，部分肺泡壁断裂，大量炎症细胞浸润，肺水肿明显(图1c)。

a: IR组b： IPC组c： IPOST组

图1肺组织病理改变(HE×100)

2.3不同时间点PaO2的变化各组动物不同时间点PaO2含量差异有统计学意义(F=306.811,P<0.05)。在60、120 min时，IPOST、IPC组PaO2高于IR组，IPOST组PaO2低于IPC组，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

2.4各组动物SOD、MDA、NO、TNF-α及肺湿/干重比的变化3组SOD、MDA、NO、TNF-α及W/D差异有统计学意义(P<0.05)。与IR组比较，IPC组SOD、NO高于IR组，而MDA、TNF-α及W/D低于IR组，差异有统计学意义(P<0.05)，IPOST组SOD、NO低于IPC组，而MDA、TNF-α及W/D高于IPC组，差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。

3　讨论

缺血预处理和后处理是机体对于缺血再灌注损伤的一种内源性保护措施，已经证实其对心、肝、脑、肾、肠道等器官缺血再灌注损伤有保护作用。在临床上肺移植术后最主要的并发症是缺血再灌注损伤(IRI)，本研究选择采用IPC和IPOST的干预方案,探讨对IRI保护作用的方法。

表1　各组动物不同时间点PaO2比较(±s)

注：与IR组比较，*P<0.05； 与IPC组比较，△P<0.05。

表2　缺血预处理、缺血后处理对缺血再灌注的保护作用比较(±s)

注：与IR组比较，*P<0.05； 与IPC组比较，△P<0.05。

Jun等[12]报道在小动物肺缺血再灌模型中，IPC可以减少IRI，降低模型死亡率。本研究在肺移植模型的缺血-再灌注损伤中，经缺血预处理和后处理干预，发现在移植后60 min和120 min时IPC组和IPOST组PaO2均高于IR组，推测IPC和IPOST均有助于提高PaO2，进一步比较发现IPC组的PaO2更高，说明IPC对IRI起到更好的保护作用。有关研究结果显示，缺血再灌注损伤肺泡结构破坏，部分肺泡壁断裂，肺泡内可见大量出血，呈现肺气肿、水肿及肺不张，W/D升高，表现为肺组织通气交换功能障碍[13-14]。本研究结果与其报道一致，IPC组病理损伤相对较轻，表现为肺泡结构不完整、水肿及气肿较轻，炎症改变相对较轻，W/D明显较IR组低，W/D可直接反映肺组织含水量，间接反映肺泡毛细血管膜通透性的改变，提示在缺血再灌注损伤时IPC可减轻肺毛细血管损伤，减少肺组织含水量，改善肺换气功能，本研究进一步验证IPC可能对IRI有保护作用。

MDA作为脂质过氧化物的代谢产物，与体内氧自由基生成水平呈正相关，在一定程度上能反映细胞损伤的程度[15]。SOD是体内抗氧化活化的重要物质，能特异性清除超氧自由基，增强机体的抗氧化能力，可促进再灌注损伤脏器的恢复[16]。本研究在缺血再灌注损伤时，经比较IPC干预措施MDA表达最低,且SOD表达最高，与IR组、IPOST组比较,差异有统计学意义(P<0.05)，可能是IPC抑制了氧自由基，减轻了肺泡细胞的损伤，这一结果与病理结果相一致。NO作为体内重要的血管活性物质，具有舒张血管和局部抗炎的功能[17]，肺内主要表达eNOS，维持肺血管平滑肌适当张力，使肺通气与血流灌注维持恒定，在IRI，血管通透性增强，来源于eNOS的NO表达降低或是活性降低[18]。本研究显示，在IRI，IPC组干预措施NO表达最高，推测IPC可通过提高机体NO水平，间接抑制中性粒细胞聚集，减少超氧阴离子的产生，引起内源性抗氧化酶等活性增强，从而减轻IR损伤。TNF-α是IR早期促炎细胞因子，其主要通过促进细胞因子的产生、中性粒细胞释放氧自由基和蛋白酶等导致或加重缺血再灌注损伤[19]。本研究显示，经比较IPC干预措施TNF-α表达最低，而IR组表达最高，在IR时，大量细胞因子激发中性粒细胞释放氧自由基引起肺组织损伤，另外TNF-α是造成肺损伤重要的细胞因子之一[19]。本研究IPC组中TNF-α表达较低，可能是IPC时高表达的SOD抑制了增强机体的抗氧化能力，同时低表达的TNF-α不足以导致肺组织严重损伤，因此IPC组的病理损伤表现较轻，死亡率最低。

本研究结果表明，在新西兰大白兔肺移植的缺血-再灌注损伤过程中缺血预处理和后处理方案对再灌注损伤均有保护作用，但缺血预处理方案效果最佳。

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(本文编辑杨晨晨)

Comparation of the protective effection between ischemic preconditioning and ischemic postconditioning on lung transplantation ischemia reperfusion injury in Rabbits

WEI Qin1， LIU Yuanyuan2， JIANG Tao1， MA Mei3， ZHANG Chun1， Yiliyaer Xiaheding4， ZHU Hui4

(1XinjiangKeyLaboratoryofMedicalanimalModelResearch,ClinicalMedicalResearchInstitute;2SecondaryDisinfectionSupplyRoom;3TeachingSection;4ThoracicSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054，China)

ObjectiveTo compare the protective effects of ischemic preconditioning and ischemic postconditioning in ischemic reperfusion injury in a rabbit lung transplantation model. Methods48 rabbits were randomly divided into three groups：ischemia reperfusion, ischemic preconditioning, ischemic postconditioning. The PaO2reperfusion after transplantation at 60 min, 120 min were monitored. The pathological changes, serum superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA), nitric oxide (NO), tumor necrosis factor alpha (TNF -α) and lung wet/dry weight ratio were assessed. ResultsAfter the model of left lung transplantation were established successfully，ischemia reperfusion injury were treated by two methods of intervention of ischemic preconditioning and postconditioning . Pathology showed that ischemic preconditioning and postconditioning can reduce lung injury, but ischemic preconditioning was better;There was significant difference in PaO2content at different times (P<0.05). At 60 min, 120min, in IPC and IPOST group, PaO2were higher than that in the IR group, which in IPOST group was lower than that in the IPC group, and the differences were statistically significant (P<0.05); SOD, MDA, NO, TNF-α and W/D in 3 groups were statistically significant different (P<0.05). Compared the IR group, SOD and NO in IPC group was higher while MDA, TNF-α and W/D were lower, and the differences were statistically significant (P<0.05). SOD and NO in IPOST group was less than those in the IPC group, while MDA, TNF-α and W/D were higher than those in IPC group, and the differences were statistically significant (P<0.05). ConclusionBoth ischemic preconditioning and postconditioning can reduce the ischemia reperfusion injury of transplanted lung, and the effects of ischemic preconditioning is stronger.

ischemic preconditioning; ischemic postconditioning； ischemia reperfusion injury； lung transplantation

新疆维吾尔自治区自然科学基金(2015211C083)

魏琴(1980-),女，研究生，实验师，研究方向：动物模型制作。

朱辉,男，博士，主任医师，研究方向：心胸疾病的诊治，E-mail:zhuhui1973@163.com。

R363

A

1009-5551(2016)10-1281-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.10.017

2016-04-13]