新疆地区维吾尔族2型糖尿病视网膜病变与VEGF、ICAM-1 K469E、EPO及TCF7L2基因多态性的相关性研究

李　丽， 易湘龙， 顾永欣， 钱　一， 郑坤坤

(新疆医科大学1第五附属医院眼科， 乌鲁木齐　830000, 2第一附属医院眼科， 乌鲁木齐　830054；3中国人民解放军474医院， 乌鲁木齐　830013)



新疆地区维吾尔族2型糖尿病视网膜病变与VEGF、ICAM-1 K469E、EPO及TCF7L2基因多态性的相关性研究

李丽1， 易湘龙2， 顾永欣3， 钱一2， 郑坤坤2

(新疆医科大学1第五附属医院眼科， 乌鲁木齐830000,2第一附属医院眼科， 乌鲁木齐830054；3中国人民解放军474医院， 乌鲁木齐830013)

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)基因 K469E、促红细胞生成素(EPO)及转录因子7类似物(TCF7L2)基因多态性与新疆维吾尔族2型糖尿病视网膜病变的关系。方法321例新疆维吾尔族T2DM患者入选，其中非增殖性糖尿病视网膜病变患者104例(NPDR组)，增殖性糖尿病视网膜病变患者87例(PDR组)，无糖尿病视网膜病变患者130例(T2DM组)。抽取血液样本提取DNA。采用iMLDR技术进行VEGF、ICAM-1 K469E、EPO及TCF7L2基因分型，计算等位基因及基因型并进行χ2检验 。结果3组间rs3025039基因型及等位基因分布频率比较差异有统计学意义(P<0.001)，rs5498、 rs1617640和rs7903146基因型及等位基因分布频率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论新疆维吾尔族DR发生与VEGF基因多态性有关，而与ICAM-1 K469E、EPO及TCF7L2基因多态性无关。

糖尿病视网膜病变； 基因多态性； 维吾尔族

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)最常见并发症之一，有较高的致盲率。DR与多种危险因素密切相关，如年龄、高血压、糖化血红蛋白及性别等[1]，但不同地区、不同种族患病率存在差异[2-6]。提示基因在DR的发生、发展中可能起着重要的作用。因此，近年来越来越多的研究涉及DR的候选基因。本研究通过iMLDR技术进行SNP分型，检测并分析新疆地区维吾尔族2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)患者血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)(rs3025039)、细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1) K469E(rs5498)、促红细胞生成素(erythropoietin, EPO) (rs1617640)及核转录因子7类似物2基因(transcription facor 7-like 2, TCF7L2)(rs7903146)基因多态性，探讨VEGF、ICAM-1 K469E、EPO及TCF7L2基因多态性与2型糖尿病视网膜病变的相关性。

1　对象和方法

1.1研究对象筛选2014年1月-2015年12月在新疆医科大学第一附属医院眼科及第五附属医院住院患者。纳入标准：(1)新疆地区常年居住的维吾尔族居民；(2)T2DM病程≥3 a者；(3)已接受胰岛素或口服降血糖药物治疗者；(4)同意血样抽取行DNA检查者。排除标准：(1)T1DM患者；(2)急性或慢性炎症者；(3)肾功能衰退者；(4)与已入选对象有血缘关系者。321例新疆维吾尔族T2DM患者入选，其中非增殖性糖尿病视网膜病变患者104例(NPDR组)(年龄49～82岁，DM病程4～31 a，糖化血红蛋白6.5%～8.8%)，增殖性糖尿病视网膜病变患者87例(PDR组)(年龄47～79岁，DM病程4～27 a，糖化血红蛋白6.6%～9.2%)，无糖尿病视网膜病变T2DM患者130例(T2DM组)(年龄44～82岁，DM病程4～28 a，糖化血红蛋白5.6%～8.9%)。其中NPDR患者104例(年龄52～78岁，DM病程3～32 a，糖化血红蛋白6.7%～9.8%)，PDR患者87例(年龄53～76岁，DM病程4～27 a，糖化血红蛋白6.9%～9.2%)，无糖尿病视网膜病变T2DM患者130例(年龄54～82岁，DM病程4～33 a，糖化血红蛋白5.8%～8.3%)。DR分期标准依据《我国糖尿病视网膜病病变临床诊疗指南(2014年)》[7]。本研究遵循Helsinki宣言，经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会讨论通过，所有患者均签署知情同意书。

1.2主要试剂引物(上海生工生物工程公司),Taq DNA聚合酶(Qiagen公司，Inc.),dNTP(GENERAY BIOTECH),PCR反应缓冲液(Takara),PCR Marker(NEW ENGLAND Biolabs),琼脂糖(BIOWEST)。

1.3方法

1.3.1DNA提取用EDTA试管抽取外周全血5 mL保存于-20℃，提取的DNA保存在-70℃备用。DNA样本取1 μL 1% agarose电泳对其样本进行质量检查以及浓度估计，然后根据估计的浓度将样本稀释到工作浓度5～10 ng/μL。

1.3.2PCR扩增PCR条件：反应体系(10 μL)包含1×HotStarTaq 缓冲液、3.0 mmol/L Mg2+、0.3 mmol/L dNTP、1 U HotStarTaq 聚合酶、1 μL样本DNA和1 μL多重PCR引物。反应的热循环条件如下：95℃ 2 min预变性；94℃ 20 s，65℃ 40 s，72℃ 1.5 min，11个循环；94℃ 20 s，59℃ 30 s，72℃ 1.5 min，24个循环；最后72℃延伸2 min；4℃保存。引物序列见表1。

表1　引物

1.3.3PCR产物纯化在10 μL PCR产物中加入5 U SAP酶和2 U Exonuclease I酶，37℃温浴1 h, 然后75℃灭活15 min。连接引物反应体系：10×连接缓冲液 1 μL、高温连接酶 0.25 μL、5′连接引物混合液(1 μmol/L)0.4 μL、3′连接引物混合液(2 μmol/L)0.4 μL、纯化后多重PCR产物 2 μL、ddH2O 6 μL 混匀。取0.5 μL稀释后的连接产物，与0.5 μL Liz500 SIZE STANDARD， 9 μL Hi-Di 混匀， 95℃变性5 min后上ABI3730XL测序仪。ABI3730XL测序仪上收集的原始数据用GeneMapper 4.1 (AppliedBiosystems, USA) 进行分析。

2　结果

2.13组一般资料的比较3组年龄、DM病程、糖化血红蛋白均有差异(P<0.001)，经两两比较，无DR的T2DM组患者糖化血红蛋白最低，NPDR组与T2DM组、PDR组的年龄、DM病程均不同(P<0.05))，而PDR组与T2DM组年龄、DM病程差异无统计学意义(P>0.05)。3组性别差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2　3组一般资料比较(±s)

2.2Hardy-Weinberg平衡检验rs3025039、rs5498、rs1617640及rs7903146位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，见表3。

表3　Hardy-Weinberg平衡检验

2.33组VEGF、ICAM-1 K469E、EPO及TCF7L2基因型与等位基因频率分布的比较3组VEGF基因型与等位基因频率分布均存在差异(P<0.001)，余基因均未发现不同(P>0.05)，见表4。

经两两比较，VEGF基因(rs3025039)的C/T型存在DR发生的风险性(OR=2.580，95%CI 1.415～4.706)，C等位基因是危险因子(OR=5.693，95%CI 3.827～8.468)，而T等位基因是发生PDR的危险因子(OR=7.152，95%CI 4.364～11.721)，见表5。

DR患者与无DR的T2DM患者VEGF、ICAM-1 K469E、EPO及TCF7L2等位基因频率分布的比较见表6，仅VEGF基因(rs3025039)分布有差异(P<0.001)。

3　讨论

DR是DM最常见的微血管并发症，是致盲的重要病因，严重影响了患者的生活质量。然而DR发病机制复杂。本研究筛选新疆维吾尔族T2DM人群,通过imLDRTM 多重SNP分型试剂盒对321个样本进行SNPs位点分型，检测VEGF、ICAM-1 K469E、EPO及TCF7L2的基因多态性。

表43组VEGF、ICAM-1 K469E、EPO及TCF7L2基因型与等位基因频率分布的比较/例(%)

SNP位点/基因NPDRPDRT2DMχ2Prs3025039 C/T21(20.2)26(17.8)16(19.3) C/C75(72.3)118(80.8)68(79.2)103.536<0.001 T/T78(75.0)2(1.4)3(3.5) C171(49.1)262(89.7)152(87.4)122.122<0.001 T177(50.9)30(10.3)22(12.6)rs5498 G/A49(46.8)48(32.9)44(50.9) A/A39(37.2)17(11.6)29(33.3)1.9100.752 G/G16(16.0)81(55.5)14(15.8) G81(38.9)210(71.9)72(41.4)0.2350.889 A127(61.1)358(68.3)102(58.6)rs1617640 C/A53(51.1)68(46.6)51(57.9) A/A33(31.9)25(17.1)27(31.6)5.3050.257 C/C18(17.0)53(36.3)9(10.5) C89(42.8)174(59.6)69(39.7)2.7150.257 A119(57.2)118(40.4)105(60.3)rs7903146 C/T40(38.3)26(17.8)30(35.1) C/C60(57.4)118(80.8)53(61.4)0.6310.960 T/T4(4.3)2(1.4)4(3.5) C160(76.9)30(10.3)136(78.2)0.1700.919 T48(23.1)262(89.7)38(21.8)

表5　3组VEGF、ICAM-1 K469E、EPO及TCF7L2基因型及等位基因频率分布两两比较

表6　DR患者与T2DM组VEGF、ICAM-1 K469E、EPO及TCF7L2等位基因频率分布的比较/例(%)

VEGF促进DR新生血管形成，是DR发生与发展的关键因子，且为DR的始动因子，VEGF即成为了基因研究的主要目标之一。以往研究表明VEGF与DR的发病有相关性[8-9]，且VEGF与DR的严重程度有关[10]。本研究结果表明VEGF基因(rs3025039)的C/T型存在DR发生的风险性(OR=2.580，95%CI 1.415～4.706)，C等位基因是危险因子(OR=5.693， 95%CI 3.827～8.468)，而T等位基因是发生PDR的危险因子(OR=7.152， 95%CI 4.364～11.721)。

徐晓鹤等[11]研究表明炎症反应及ICAM-1在内的细胞因子对DR起重要作用。朱捷等[12]研究表明ICAM-1 K469E基因多态性与DR有关。而本研究未发现ICAM-1 K469E与DR的发生存在相关性。考虑可能与样本量和种族不同有关。

EPO可通过其异源二聚体受体CD131发挥抑制细胞凋亡和保护神经细胞的作用，从而减少DR神经组织的结构损伤，但是又具有促进视网膜新生血管形成、加重DR血管病变的潜在危险[13]。本研究未发现EPO与DR发生存在相关性，与Hosseini等[14]研究结果不尽相同。

TCF7L2位于人类10号染色体长臂25区，很多研究表明，TCF7L2基因是T2DM最重要的致病基因。然而，王志强等[15]和Dou等[16]研究表明TCF7L2(rs7903146)与中国汉族人群T2DM无相关性。Buraczynska等[17]研究波兰高加索人TCF7L2(rs790346)基因多态性与DR发病风险不存在相关性。付丽丽等[18]的研究亦未发现TCF7L2与中国汉族DR发生有关的证据。本研究表明TCF7L2与DR发病或DR严重程度不存在相关性。

新疆当地居民饮食习惯喜好高脂、多盐以及高糖食物, 少食蔬菜而多食面食, 这样长期不合理饮食结构的背景形成了新疆本地居民DM及DR高发的地域特点[19-21]。本研究仅发现新疆维吾尔族DR发生与VEGF基因多态性有关，而与ICAM-1 K469E、EPO及TCF7L2基因多态性无关，这为DR候选基因研究提供了新的实验依据。

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(本文编辑张巧莲)

Association of genetic polymorphism of VEGF, ICAM-1 K469E, EPO and TCF7L2 genes with diabetic retinopathy of type 2 diabetes mellitus in Uyghur population in Xinjiang

LI Li1， YI Xianglong2， GU Yongxin3， QIAN Yi2， ZHENG Kunkun2

(1DepartmentofOphthalmology,theFifthAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830000,China；2DepartmentofOphthalmology,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China；3DepartmentofOphthalmology,Chinapeople′sLiberationArmy474Hospital,Urumqi830013,China)

ObjectiveTo investigate the association of genetic polymorphism of VEGF, ICAM-1 K469E, EPO and TCF7L2 genes with diabetic retinopathy (DR) of type 2 diabetes mellitus in Uyghur population in Xinjiang. Methods321 patients of T2DM in Uyghur population were screened，including 104 patients with nonproliferative retinopathy (NPDR), 87 patients with proliferative retinopathy (PDR), and 130 patients without diabetic retinopathy (T2DM). DNA was extracted from blood samples. VEGF, ICAM-1 K469E, EPO and TCF7L2 genes were genotyped using iMLDR technique. Allele and genotype frequencies were compared among three groups using the χ2test. ResultsThe genotype and allele frequencies of rs3025039 were different among three groups, and of rs5498, rs1617640 and rs7903146 were not different among three groups (P>0.05). ConclusionPolymorphism of VEGF gene is associated with DR. There were no correlation between gene polymorphism of ICAM-1 K469E, EPO and TCF7L2 and DR of T2DM in Uyghur population in Xinjiang.

diabetic retinopathy; gene polymorphisms; Uyghur population

国家自然科学基金(81260150，81560161)；国家教育部高等学校博士学科点专项科研基金新教师类(20126517120004)；中国博士后科学基金面上资助(2014M562485)；新疆医科大学第一附属医院青年科研基金(2012QN08)

李丽(1980-)，女，主治医师，研究方向：眼底疾病诊断与治疗。

易湘龙，男，主任医师，副教授，硕士生导师，研究方向：眼底病近视矫正及角膜移植，E-mail: xly1010@sina.com。

R77; R34

A

1009-5551(2016)10-1267-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.10.014

2016-03-16]