2种口腔常见菌在3种RPD常用基托材料表面粘附性能的比较

王建青, 苏　彬, 刘素辉, 张晓波, 程路峰

(乌鲁木齐市口腔医院1修复科, 2温泉门诊部, 乌鲁木齐　830002; 新疆医科大学3基础医学院微生物教研室, 4厚博学院微生物教研室,5基础医学院药理学教研室, 乌鲁木齐　830011)



2种口腔常见菌在3种RPD常用基托材料表面粘附性能的比较

王建青1, 苏彬2, 刘素辉3, 张晓波4, 程路峰5

(乌鲁木齐市口腔医院1修复科,2温泉门诊部, 乌鲁木齐830002; 新疆医科大学3基础医学院微生物教研室,4厚博学院微生物教研室,5基础医学院药理学教研室, 乌鲁木齐830011)

目的比较可摘局部义齿(RPD)修复初期变形链球菌和白假丝酵母菌在纯钛基托、钴铬合金基托和树脂基托3种义齿材料的表面粘附性能。方法将3种RPD基托材料制成统一规格的试件，分别放入含变形链球菌CDC厌氧培养液和白假丝酵母菌的沙堡弱培养液中。于6、24、48 h定量检测试件表面粘附的细菌数量。结果变形链球菌在3种基托材料表面粘附6 h后均检出细菌，以粘附24 h后检出菌落最多。白假丝酵母菌在3种材料表面粘附24 h后均检出细菌，也以粘附24 h后检出菌落最多。2种细菌在3种材料中的粘附能力比较顺序由小到大均为：纯钛<钴铬合金<树脂基托材料。结论3种基托材料口腔放置后6 h是变形链球菌定殖的关键期，而24 h是白假丝酵母菌定殖的关键期。纯钛基托与钴铬合金基托和树脂基托比较，粘附的细菌最少。

细菌粘附； 变形链球菌； 白假丝酵母菌

在人体口腔中粘附大量的细菌，健康的机体口腔微生物与宿主细胞之间保持相对平衡的状态。然而，当口腔使用了修复体之后，牙周病、义齿性口炎、龋坏以及种植体周围炎等医源性口腔疾病发生率明显增加，这类疾病和相应的并发症也是导致口腔修复治疗失败的原因之一[1]。修复体表面粗糙、外形不佳及自洁作用差从而引起病原微生物的粘附是这些疾病发生、发展的主要原因[2-3]。在不同细菌对口腔修复体的粘附研究中发现：不同种类的细菌往往表现出不同的粘附能力[4]。因此，在口腔治疗中，选用具有良好的性能且不易被细菌粘附的材料是口腔学研究者共同关心的问题[5]。

本研究以常见口腔致病菌变形链球菌和白假丝酵母菌为观察对象，检测2种菌体在钴铬合金基托、纯钛基托和树脂基托3种常用可摘局部义齿(RPD)材料表面粘附的情况，分析RPD修复初期，变形链球菌和白假丝酵母菌在修复体表面粘附的先后顺序和定殖数量，旨在为临床选择合适的义齿基托材料并尽可能减少细菌在修复体表面粘附和定殖提供理论参考。

1　材料与方法

1.1实验材料本实验菌株变形链球菌和白假丝酵母菌均购自中科院北京微生物研究所。实验试件中常用基托材料，包括纯钛、钴铬合金及树脂基托材料等均由广东省口腔医院粤诚义齿技术开发中心统一制作。变形链球菌细菌培养使用CDC培养基，真菌的培养使用沙堡弱培养基，以上培养基均购自杭州天和微生物试剂有限公司。一次性厌氧培养袋购自法国生物梅里埃有限公司。

1.2实验方法

1.2.1基托材料制作与菌种复苏基托材料制作参照文献[6]。实验所用变形链球菌干燥管中加入无菌生理盐水，待细菌溶解后，接种于CDC培养基平板，装入厌氧袋种，置于37℃培养箱，进行菌种复苏，培养3～5 d，鉴定备用。实验所用白假丝酵母菌接种于沙堡弱琼脂培养基，置于35℃培养箱，有氧条件下24～48 h传代培养、鉴定后备用。1.2.2实验菌液配制(1)用无菌接种环刮取CDC培养基平板上的变形链球菌菌落，溶于无菌生理盐水中，用麦氏比浊管比浊，初步判断菌液浓度为109～1010CFU/mL，采用倍比稀释法稀释做倾注平板计数，以106～107CFU/mL为工作浓度。以倾注平皿计数结果为准，记录为最终实验浓度。变形链球菌计数浓度3.6×109CFU/mL，工作浓度为3.5×108CFU/mL。(2)用无菌接种环刮取沙堡弱琼脂培养基平板上的白假丝酵母菌落，溶于无菌生理盐水中，用麦氏比浊法，初步判断菌液浓度为104～105CFU/mL，采用倍比稀释法做倾注平板计数，工作浓度为103～104CFU/mL。以倾注平皿计数结果为准，记录为最终实验浓度。白假丝酵母菌液浓度为3.1×104CFU/mL，工作浓度为3.1×103CFU/mL。

1.2.3菌种粘附实验所有基托材料在75%的酒精中浸泡24 h，紫外灯下正反面照射4 h。然后将18个基托材料置于内径90 mm的培养皿中，在面朝上的实验面上加入20 mL的人工唾液，合盖后在超净工作台上常温静置1 h。以上实验结束后，用无菌镊子取出实验试件，置于另一干净的培养皿中，其中9个基托材料各加入1 mL变形链球菌悬液后快速放置厌氧袋中进行培养；另外9个基托材料则加入白假丝酵母菌悬液各1 mL后快速放置35℃培养箱进行培养。

1.2.4细菌粘附量的测定分别于6、24、48 h后，取出纯钛、钴铬合金、树脂基托材料各3个。将各试件用PBS缓冲液冲洗5次，放入5 mL离心管中，分别加入2 mL相应变形链球菌或白假丝酵母菌的培养液。将各离心管放在漩涡混合器上振荡30 s，用微量取样枪取0.1 mL菌液，注于培养基平板上充分涂布均匀，培养6、24、48 h后，进行菌落形成单位计数。所有样本的细菌计数均采用细菌菌落形成单位(CFU/mL)表示。

1.3统计学处理应用 SPSS22.0统计软件包进行分析。各项指标经正态性及方差齐性检验，多组比较采用ANOVA单因素方差分析(F检验)，以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

3种基托材料包埋6 h均可检出变形链球菌菌落，于24 h变形链球菌菌落数粘附均达高峰，48 h后均回落减少，甚至未检出菌落(图1A)。同一材料3个时间点变形链球菌菌落粘附量总体差异均有统计学意义(P均<0.01)，进一步两两比较，除树脂基托材料6 h与48 h时变形链球菌菌落粘附量差异无统计学意义外，其余时间点两两之间比较差异均有统计学意义(P均<0.01)。在3个时间点，3种基托材料表面检出变形链球菌菌落数由少到多依次为：纯钛<钴铬合金<树脂基托材料，总体差异均有统计学意义(P均<0.01)。6 h和24 h时，3种材料表面检出变形链球菌菌落数，两两比较差异均有统计学意义(P均<0.01)(表1)。3种基托材料包埋6 h白假丝酵母菌均未检出，于24 h细菌菌落数粘附均达高峰，48 h后均回落减少，甚至未检出菌落(图1B)。同一材料3个时间点白假丝酵母菌菌落粘附量总体差异均有统计学意义(P值均<0.01)，进一步两两比较，除纯钛与钴铬合金基托材料6 h与48 h菌落粘附量差异无统计学意义外，其余时间点两两之间菌落粘附量差异均有统计学意义(P均<0.01)。在24 h和48 h时，3种基托材料表面检出白假丝酵母菌菌落数由少到多依次均为：纯钛<钴铬合金<树脂基托材料，总体差异均有统计学意义(P均<0.01)。进一步两两比较，24 h和48 h时，3种基托材料白假丝酵母菌菌落粘附量差异均有统计学意义(P24 h均<0.01，P48 h均<0.05)(表1)。

表1　6、12及24 h时变形链球菌和白假丝酵母菌在3种基托材料的粘附力检测结果(CFU/mL， ±s)

A: 变形链球菌粘附菌落数 B: 白假丝酵母菌粘附菌落数

图1不同时间点3种基托材料粘附菌落数

3　讨论

RPD在口腔的植入可能诱发口腔黏膜损伤而致义齿性口炎、牙周病、黏膜刺激性增生和创伤性溃疡等并发症的发生。这除了与个体易感性及口腔卫生有关外，还与口腔病原微生物致创面感染及修复体表面的粘附有关。因此，关于细菌在RPD表面早期粘附的研究则显得较为重要。变形链球菌与白假丝酵母菌是2种重要口腔致病菌。变形链球菌与牙齿表面细菌生物膜的形成和积聚有着密切关系[7]，而RPD材料表面细菌生物膜的形成与促进微生物致口腔内组织的腐蚀之间有着高度相关性[8]。唾液中白假丝酵母菌数量的增加可能是导致义齿性口炎的重要潜在因素[9-10]。所以，一种好的义齿修复材料需同时具备良好的机械性能和生态学性能，以维持口腔微生态的相对平衡，防止微生态失调出现新的疾患[11-12]。

本研究结果表明，6 h时3种基托材料均有变形链球菌检出，24 h细菌菌落最多，因此6 h对于变形链球菌来说是关键期，此期应做好义齿和口腔的清洁，防止基牙龋坏。而对于白假丝酵母菌，6 h时3种基托材料均未检出，而24 h细菌菌落数最多，因此24 h是白假丝酵母菌的关键期，此期做好义齿和口腔的清洁有利于防止义齿性口炎的发生。2种细菌在3种基托材料的粘附能力表明，在不同时间点，均为树脂基托材料菌落数最多，纯钛基托材料最少。这可能是因为树脂易发生变性、老化，细菌易于粘附；钴铬合金中的金属离子与细菌结合形成络合物，破坏了细菌生物膜性能，故细菌粘附作用较弱；纯钛因含有强烈钝化倾向的钛成分而形成稳定的氧化膜而阻止了微生物的侵入[13]，故细菌粘附最少，表现出良好的抗菌能力。

综上，3种材料口腔放置后6 h是变形链球菌定殖的关键期，此期应做好义齿的清洁，防止基牙龋坏的发生。而24 h是白假丝酵母菌定殖的关键期，此期应做好义齿的清洁，可以防止义齿性口炎的发生。纯钛基托与树脂基托和钴铬合金基托相比，各实验时间段粘附的细菌数较少。本研究结果为新型义齿材料的进一步优化及完善奠定了实验室研究基础。

[1]王晓伟, 姚国强, 高鹏飞，等. 乳酸菌对重金属污染的生物修复作用[J]. 中国微生态学杂志, 2014, 26(8):968-972.

[2]刘涛, 吕一品, 姚辰琛，等. 口腔微生态的研究进展[J]. 生命科学研究, 2012, 16(5):466-470.

[3]熊萍, 唐运涛, 陈宏刚，等. 种植体周围炎病菌变化研究[J]. 现代预防医学, 2014, 41(22):4189-4191.

[4]MacInnes SJ, Vescovo D, Kiss-Toth E, et al. Genetic variation in inflammatory and bone turnover pathways and risk of osteolytic responses to prosthetic materials[J]. J Orthop Res, 2015, 33(2):193-198.

[5]Filiz Aykent, Isa Yondem, Atilla G, et al. Effect of different finishing techniques for restorative materials on surface roughness and bacterial adhesion[J]. J Prosthet Dent, 2010, 103:221-227.

[6]丁宁, 张祖太, 何敏,等. 几种常用口腔材料细菌粘附性能比较[J]. 北京口腔医学, 2014, 22(5):258-260.

[7]刘奕, 费伟, 王丽娜,等. 十肽对变异链球菌生物膜生长和结构影响的实验研究[J]. 国际口腔医学杂志, 2015, 42(4):401-405.

[8]Simón-Soro A, Mira A. Solving the etiology of dental caries[J]. Trends Microbiol, 2015, 23(2):76-82.

[9]Dovigo LN, Carmello JC, de Souza Costa CA, et al. Curcumin-mediated photodynamic inactivation of Candida albicans in a murine model of oral candidiasis[J]. Med Mycol, 2013, 51(3):243-251.

[10]Salvatori O, Puri S, Tati S, et al. Innate immunity and saliva in Candida albicans-mediated oral diseases[J]. J Dental Res, 2016, 95(4):365-371.

[11]刘涛, 吕一品, 姚辰琛,等. 口腔微生态的研究进展[J]. 生命科学研究, 2012, 16(5):466-470.

[12]Carinci F, Scapoli L, Girardi A, et al. Oral microflora and periodontal disease:new technology for diagnosis in dentistry[J]. Ann Stomatol, 2013, 4(2):170-173.

[13]孙皎. 近五年我国口腔材料的研究概况[J]. 口腔材料器械杂志, 2014, 23(1):1-8.

(本文编辑周芳)

A comparison of adhesion status of 2 oral common bacteria on the surface of 3 types of RPD common denture base materials

WANG Jianqing1, SU Bing2, LIU Suhui3, ZHANG Xiaobo4, CHENG Lufeng5

(1DepartmentofProsthodontics,2SPADepartment,UrumqiStomatologicalHospital,Urumqi830002,China;3DepartmentofMicrobiology,SchoolofPre-clinicalMedicine,4DepartmentofMicrobiology,SchoolofHoubo,5DepartmentofPharmacology,SchoolofPre-clinicalMedicine,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

ObjectiveTo compare with adhesive capability of 2 oral common bacteria on the surface of 3 types of base materials at the earlier RPD restoration. MethodsManufactured uniform test specimens for pure titanium, cobalt chromium (Co-Cr) alloy and resin denture base, and then put them into CDC anaerobic culture medium containing Streptococcus mutans and Sabourauad culture medium containing Candida albicans, after 6 h, 12 h and 24 h, quantitatively detected and compared the adhesive quantities on the surface of the materials respectively. ResultsStreptococcusM. could be detected out from the 3 denture bases after 6 h, especially bacterial colonies were the most at 24 h, while Candida A. could not be detected out from the 3 denture bases at 24 h, and also bacterial colonies were the most at 24 h. The sequence of the adhesive capability of the 2 bacteria on the surface of the 3 denture bases were: pure titanium denture

pure titanium; bacteria adhesion; Streptococcus Mutant; Candida Albicans

乌鲁木齐市卫生局科学技术计划项目(201319)

王建青(1979-)，女，硕士，副主任医师，研究方向：口腔修复学。

程路峰，男，博士，教授，研究方向：免疫药理学，E-mail: lewis_clf@163.com。

R780.2

A

1009-5551(2016)10-1250-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.10.010

2016-06-17]