联合应用多种技术分析性别异常者

黄江平，沈 军，曹 禹，平 原

（1.上海市公安局物证鉴定中心法医物证学现场应用技术公安部重点实验室，上海200083；2.上海市崇明县公安局 刑侦大队刑事科学技术室，上海202150）

鉴定实践
Forensic Practice

联合应用多种技术分析性别异常者

黄江平1，沈 军2，曹 禹1，平 原1

（1.上海市公安局物证鉴定中心法医物证学现场应用技术公安部重点实验室，上海200083；2.上海市崇明县公安局 刑侦大队刑事科学技术室，上海202150）

目的 对1例Amelogenin基因座分型结果为“X，Y”的“女性”进行分子遗传学分析。方法 采用PCR-STR技术检测Y-STR和X-STR基因座，实时荧光定量PCR技术检测SRY基因，原位荧光杂交（FISH）技术分析外周血细胞性染色体情况。结果 采用Y-filer试剂盒仅检见短臂上的4个Y-STR基因座，AGCU X19试剂盒的19个X-STR基因座全部检出，但均为纯合子；SRY基因检测为阳性；外周血细胞FISH检测结果显示只有一条X染色体。结论 推断该个体是伴有Y染色体物质隐匿嵌合的Turner综合征患者。在法医物证检验中，应重视该类社会性别与Amelogenin基因座检测结果不符的特殊个体，防止发生性别误判。

法医遗传学；Turner综合症；FISH技术；PCR-STR技术；实时荧光定量PCR技术；X-STR；Y-STR；SRY基因

性别鉴定是法医物证鉴定工作的重要部分之一。然而，很多内源性和外源性的原因导致一些个体出现Amelogenin基因座检测结果与其社会性别不符的情况。本文联合应用多种技术对法医日常检案中遇到的1名Amelogenin基因座分型结果为“X，Y”的“女性”个体进行分子遗传学分析，为以后的性别鉴定工作提供借鉴。

1　材料和方法

1.1简要案情

陈某，社会性别女，为一起入室盗窃强奸案件的被害人，送检陈某血样做对照样本。经调查，陈某为女性表型，有男性配偶，无子女。

1.2样本材料

陈某血样和陈某外周抗凝血。

1.3主要仪器和试剂

9700型PCR扩增仪（美国AB公司）；3100XL型遗传分析仪（美国AB公司）；7500实时荧光定量PCR扩增仪（美国AB公司）；ThermoBriteTM分子杂交仪（美国Thermo Brite公司）AmpF STRR○IdentifilerTM试剂盒（美国AB公司）；Powerplex 21试剂盒（美国Promega公司）；AmpF STRR○Y-filerTM试剂盒（美国AB公司）；AGCU X19试剂盒（无锡中德美联公司）；QuantifilerR○Duo DNA Quantification Kit（美国AB公司）；Vysis 30-161050 CEP X/Y DNA Probe试剂盒（美国Vysis公司）。

1.4基因组DNA提取

血样采用Chelex-100法提取基因组DNA。

1.5PCR-STR检测

1.5.1常染色体STR和Amelogenin基因座扩增

分别采用 AmpF STRR○IdentifilerTM试剂盒和Powerplex21试剂盒。使用25μL扩增体系，按说明书进行PCR扩增。PCR反应在9700扩增仪上进行。

1.5.2Y-STR扩增

采用AmpF STRR○Y-filerTM试剂盒，按说明书进行Y-STR基因座多重PCR扩增，PCR反应体积为25μL。PCR反应在9700扩增仪上进行。

1.5.3X-STR扩增

采用AGCU X19试剂盒，按说明书进行X-STR基因座多重PCR扩增，总PCR反应体积为25μL。PCR反应在9700扩增仪上进行。

1.5.4STR扩增产物的检测

按照说明书将不同的PCR扩增产物与Hi-Di甲酰胺-内标混匀、离心，95℃变性5min，通过3100XL遗传分析仪进行毛细管电泳，收集电泳信息，然后用基因分析软件 GeneMapper 3.2检测各基因座的基因型。

1.6实时荧光定量PCR技术

用QuantifilerR○Duo DNA Quantification试剂盒参照技术手册在7500实时荧光定量PCR仪上进行TaqMan荧光探针法定量，反应体系为25μL，包括：反应混合液 12.5 μL、引物混合液 10.5 μL、DNA模板：2μL。循环参数：50°C 2 min；95°C 10min；95°C 15；60°C 1 min for 40 cycles。扩增的靶基因情况见表1。

1.7荧光原位杂交（FISH）技术

将外周血细胞沉淀在Membrane Slide 1.0 PET（德国ZEISS）玻片上涂片后置Thermo BriteTM分子杂交仪上56℃烘干2h以上；将玻片依次过70%、85%、100%酒精各1min空气中干燥；选定杂交区域，加4μLVysis30-161050 CEP X/Y DNA Probe试剂盒X、Y探针杂交液，盖上盖玻片，用胶封片，置杂交仪76℃变性3min，39℃避光过夜；次日去除盖玻片，74℃水浴中0.4×SSC洗涤2min，室温下2×SSC/ 0.1%NP-40洗涤1 min，避光晾干；杂交区域加3.5 μL DAPI复染液。Vysis CEP X的探针位置为Xq11.1-q11.1 Alpha Satellite；Vysis CEP Y的探针位置为Yq12 SatelliteⅢ。荧光显微镜下观察结果，橙色显示为CEP X阳性，绿色显示CEP Y阳性。

2　结果

2.1常染色体基因检测结果

AmpF STRR○IdentifilerTM试剂盒Amelogenin基因座的分型为“X，Y”，其余15个STR基因座为双峰或单峰，未检见两个以上的峰型，排除了由于外源性污染导致Amelogenin基因改变的可能。采用Powerplex21试剂盒复检，Amelogenin基因座分型仍为“X，Y”。

表1　QuantifilerR○Duo DNA Quantification试剂盒的靶基因

2.2Y-STR检测结果

AmpF STRR○Y-filerTM结果显示，16个Y-STR基因座中，仅短臂上的DYS393、DYS456、DYS458、DYS19这4个基因座上有特异性产物，长臂上的14个Y-STR基因座上无特异性产物（图1）。推测该个体应该具有部分Y染色体短臂上的遗传物质。

2.3X-STR检测结果

AGCU X19试剂盒的检测结果显示，18个XSTR基因座全部检出，但是，所有基因座均为纯合子，推测该个体只有1条X染色体。

2.4实时荧光定量PCR技术SRY基因检测结果

用 QuantifilerR○Duo DNA Quantification Kit试剂盒检测位于 Yp11.32的 SRY基因，结果显示阳性。

2.5荧光原位杂交（FISH）技术外周血细胞检测结果

外周血的所有细胞只显示一个橙色信号，表明该个体只有一条X染色体（图2）。

图1　AmpF/STRR○Y-filerTM分型结果

图2　外周血细胞性染色体检测结果

3　讨论

Turner综合征是女性中常见的性染色体DSD（Disorder of sex development），根据细胞核型分为4类：单一型 、嵌合型 、X染色体结构异常、含Y染色体核型，其中以单一型（45，X）最为常见，而含有Y染色体核型者较少见［1］。根据FISH和X-STR检测结果，该个体应只有一条X染色体，结合FISH、Y-STR和SRY检测结果，推断其为含Y染色体核型的Turner综合征患者。含有Y染色体核型者分为两类，一类是以独立的Y染色体形式存在的，如45，X/46，XY、45，X/ 46，XY（大Y）、45，X/47XYY等［2］；另一类是Y染色物质隐匿嵌合到X染色体上，如李程等报道了在30例为Turner综合征患者中，通过传统的细胞学核型分析，患者的分型结果为45，X/46，XX、46，XX，iX（q）、46，XX，i（Xq）/47等，后对其Y染色体上的特异序列TSPY、DYZ3、SRY进行PCR扩增和原位荧光杂交FISH，3例TSPY和DYZ3均阳性，其中1例SRY阳性［3］。本文检测的个体应该归为第二类，Y染色体短臂上物质隐匿嵌合到X染色体上的Turner综合征患者。发生机制可能是在减数分裂的过程中，该个体父亲在精子形成过程中的第一次减数分裂阶段，Yp-Xp发生易位，导致X染色体上带有SRY和AMELY基因［4］。

SRY基因决定男性的性分化，但是本案例个体SRY基因阳性却为女性表型。分析原因认为SRY基因虽然是睾丸决定因子的最佳候选基因，但是性别决定与分化是一个以SRY基因为主导的多个基因参与的有序调控的复杂过程，任一环节的误差都可能造成多种多样的性别异常。目前的研究显示，至少有6种基因（SRY，SOX9，DAX，WT1，SF1、DAX1）参与了胚胎中性别决定的形成过程［5］。

人类的性别分为染色体性别（遗传性别）、性腺性别、表型性别、社会性别等［6］。通常情况下，染色体性别控制着性腺性别分化，性腺性别支配着表型性别分化，表型性别又是社会性别的重要依据。若性别分化发生异常，会出现染色体性别、性腺性别、表型性别和社会性别不符。法医物证检验的是染色体性别，通过检测位于性染色体上的Amelogenin基因来确定X和Y染色体是否存在，从而进行性别判定。然而，性别分化异常如性反转综合症［4］，Amelogenin缺失［7］、接受异性外周血造血干细胞和骨髓移植［8］、大量输入异性血液、肿瘤组织［9］、变性手术等，都可能会导致物证的Amelogenin基因检测结果与犯罪嫌疑人的社会性别不符。

因此，应该对性别鉴定中可能会出现性别误判的情况引起重视，慎重对待每一份检材的性别分型结果。因而，法医性别鉴定结果可以作为侦查破案的重要依据，但不是唯一依据。

［1］赖力，薛士杰，金静君.1例Turner患者Amelogenin和STR基因座分型及核型分析［J］.中国法医学杂志，2011，26（6）：485-486.

［2］陈东晓，陈懿青，陈慎仁.特纳综合征30例核型及临床分析［J］.中国实用内科杂志，2005，25（6）:518-519.

［3］李程，程茜，邓兵，等.Turner综合征Y染色体物质嵌合分子遗传学研究［J］.中国实用儿科杂志，2010，25（9）:705-708.

［4］付姣.SRY、SOX 9、DAX-1基因与性反转综合征的研究进展［J］.中国优生及遗传学杂志，2009，17（3）:7-9.

［5］江静，傅曼芬，王伟，等.Turner综合征的实验临床综合研究［J］.中国优生与遗传杂志，2005，13（11）:48-50.

［6］赵刚，彭惠民.医学遗传学教程［M］.北京：科学出版社，2005:22-24.

［7］Yong R Y Y，Gan L S H，Chang Y M，et al.Molecular Characterization of a Polymorphic 3-Mb Deletion at Chromosome Yp11.2 Containing the AMELY Locus in Singapore and Malaysia Populations［J］.Hum Genet，2007，122（3-4）:237-249.

［8］周怀谷，平原，顾丽华，等.骨髓移植引出的个体识别问题［J］.法医学杂志，2003，19（4）:228-230.

［9］刘开会，王占海，季安全，等.肿瘤组织9个STR基因座及Amelogenin基因座突变［J］.中国法医学杂志，2002，17（2）:81-84.

（本文编辑：李成涛）

Application of Multiple Techniques in Analyzing Turner Syndrome Patient

HUANG Jiang-ping1，SHEN Jun2，CAO Yu1，PING Yuan1
（1.Key Laboratory of Forensic Evidence and Technology，Ministry of Public Security，Institute of Forensic Science，Shanghai Public Security Bureau，Shanghai 200083，China；2.Public Security Bureau of Chongming District，Shanghai 202150，China）

Objective To investigate the reason of sexual divergence，a female whose genotype of Amelogenin gene locus was“X，Y”，was further analyzed by molecular genetics.Methods We detected Y-STR locus and X-STR locus by PCR-STR technique，amplified SRY gene by real-time fluorescent quantitative PCR，and analyzed the peripheral blood sex chromosome by fluorescence in situ hybridization（FISH）.Results Using the AmpF/STR IdentifilerTM Kit，the individual showed only four profiles of Y-STR loucs locating on the p arm of the Y chromosome.With the AGCUX19 Kit，a full homozygous X profile was obtained.Detection of SRY gene got positive results.FISH analysis of peripheral blood cell showed only X.Conclusion We inferred that the individual suffered from Turner syndrome with Y chromosome material.Thus，the forensic relevance of the possible misinterpretation（sex is not necessarily social gender）should not be underestimated.

forensic genetics；Turner syndrome；FlSH；PCR-STR；real-time fluorescent quantitative PCR；X-STR；Y-STR；SRY gene

DF795.4

Adoi:10.3969/j.issn.1671-2072.2016.05.006

1671-2072-（2016）05-0037-04

2016-04-28

上海市科学技术委员会科研计划项目（14JG0500400）

黄江平（1984—），女，主检法医师，硕士，主要从事法医物证学研究。E-mail:183689284@qq.com。

平原（1970—），男，主任法医师，硕士，主要从事法医物证DNA分析技术的应用和研究。

E－mail：pingyuan803@163.com。