纤溶酶高产菌株的筛选与鉴定

薛　健，王　欢，尹　锐

纤溶酶高产菌株的筛选与鉴定

薛健，王欢，尹锐

（吉林农业科技学院 生物工程分院，吉林 吉林 132101）

作为一种新型的溶血栓药物，大豆类发酵食品中所含有的纤溶酶具有安全性好、作用迅速，成本低，以及可通过液体发酵大规模生产等优点。采用酪蛋白平板法与纤维蛋白平板法相结合的方法，从市售纳豆产品中分离筛选出一株高产纤溶酶生产菌，发酵48 h后，测得其粗酶活为483.72 IU/mL，通过形态学，生理生化特征，16S rDNA序列鉴定及系统发育树的分析，鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

纤溶酶；筛选；16S rDNA；鉴定

血栓性疾病严重威胁着人类的生命与健康，其发病率和死亡率高居各种疾病之首［1-2］。新型溶栓药物的开发迫在眉睫，从传统大豆类发酵食品中提取纤溶酶，是目前溶栓药物开发的新方向之一。纳豆激酶（narrokinase，NK）就是从日本传统食品纳豆中提取或纳豆菌发酵生产的一种新型纤溶酶，其分子质量远远小于尿激酶（urokinase，UK）、链激酶（streptokinase，SK）、纤溶酶原（tissue plasminogen aetivator，tPA），具有可由肠道吸收、作用迅速、持续时间长的特性，还能激活体内的tPA，使之温和、持续地提高血液的纤溶活性［3-5］。我国传统发酵食品豆豉中也被发现含有与纳豆激酶功能类似的纤溶酶［6-8］。这类来自大豆发酵食品中的纤溶酶具有诸多优点，并可由微生物液体发酵获得，酶活较高，成本低廉［9-11］，被认为是一种前景广阔的溶栓药物。

本研究利用收集的市售纳豆与豆豉样品，从中筛选出一株高产纤溶酶生产菌，并对其形态学特征、生理生化指标及分子生物学进行了鉴定，以期为心脑血管疾病相关保健产品与新型溶栓药物的开发与应用创造良好的条件。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

市售豆豉及纳豆样品共8种，分别产自国内与日本。为方便起见，命名为豆豉1#，豆豉2#，豆豉3#，纳豆1#，纳豆2#，纳豆3#，纳豆4#，纳豆5#。

纤维蛋白原（fibrinogen）、凝血酶（thrombin）、尿激酶（urokinase）、蛋白酶K、溶菌酶：美国Sigma公司；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）与溴化十六烷基三甲铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）、TE缓冲液（Tris-HCl与乙二胺四乙酸配制而成）：天津北联精细化学品开发有限公司；其他试剂均为国产分析纯。LA-TaqDNA聚合酶、DNA凝胶回收试剂盒：大连Takara公司。

斜面与平板培养基为LB固体培养基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂粉5 g/L，pH 7.0。

液体种子培养基与液体发酵培养基：采用LB液体培养基，组成除无琼脂粉外同LB固体培养基；

酪蛋白平板：酪蛋白20 g/L（于0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）中微热溶解），琼脂粉15 g/L，pH 8.0。

1.2仪器与设备

TS-211C恒温摇床：上海合恒仪器设备有限公司；TGL-16G台式离心机：上海安亭科学仪器厂；DYY-12三恒多用电泳仪：北京六一仪器厂；聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：美国伯乐公司。

1.3方法

1.3.1菌株分离

取上述不同品种的豆豉与纳豆各5粒，分别放入50 mL无菌生理盐水中，室温浸泡12 h，5 000 r/min离心10 min，弃上清，用无菌生理盐水悬垂含有菌体细胞的沉淀，以划线分离法将菌悬液涂布在LB固体培养基上，30℃培养24 h。

1.3.2酪蛋白平板初筛

挑取LB平板培养基上的单菌落接种至LB斜面培养基上，37℃活化24 h后，制备菌悬液。稀释至10-3的浓度梯度菌悬液后，分别取0.1mL稀释液涂布于酪蛋白平板，37℃培养24 h，测量酪蛋白平板透明圈直径，选取透明圈直径与菌落直径比的均值较大的菌落接种于斜面培养基培养并保藏，用于复筛。

1.3.3摇瓶复筛

将初筛获得的菌株转接于新鲜的LB固体培养基斜面，活化24 h后，接种至液体种子培养基，在37℃、180 r/min的摇床培养24 h。以1%的接种量接种至装液量为100 mL/ 250mL的液体发酵培养基中，在37℃、180 r/min摇床培养，取发酵24 h和48 h后的发酵液（实验发现，上述菌株产酶高峰主要集中在24～48 h），10 000 r/min离心，取上清液，使用纤维蛋白平板法［12］测定酶活，选取酶活最高的菌株作为纤溶酶生产菌并进行下一步鉴定。在37℃、pH 7.4条件下，1 min内溶解1 nmol纤维蛋白的纳豆激酶量为1 U。

1.3.4菌株鉴定

（1）形态学观察和生理生化鉴定

将酶活最高的菌株进行个体形态和生理生化指标鉴定［13］。

（2）菌种的基因组DNA提取

取10mL过夜培养的菌液于15mL离心管，10000r/min、4℃离心10 min，弃去上清液；菌体沉淀用3 mL TE缓冲液（pH8.0）悬浮，并加入溶菌酶（终质量浓度1mg/mL）、180μL 10%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、蛋白酶K（终质量浓度200 μg/mL），混匀，37℃温育1 h；加入720μL5mol/LNaCl，再加入500 μL十六烷基三甲基溴化铵（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）/NaCl，混匀，65℃温育30 min；用等体积酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）抽提，5 000 r/min离心10 min，移取上清液至干净离心管中；加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1）混匀，10 000 r/min、4℃离心10 min，移取上清至干净离心管中；加1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静置10 min，10 000 r/min离心10 min得到DNA沉淀；加入500μL体积分数70%乙醇，10000r/min、4℃离心10 min洗涤DNA沉淀，烘干；用20 μL TE缓冲液溶解DNA，加入终质量浓度为20 μg/mL核糖核酸酶，4℃保存。

（3）菌种的16S rDNA扩增

以细菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3′）与1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）进行16S rDNA扩增，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）反应体系体积为50 μL，包括10×PCR缓冲液（含Mg2+）5 μL；脱氧核糖核苷三磷酸（dexyribonucleoside niphosphate，dNTP）（25 mmol）4 μL；引物27F和1492R（5 μmol）各2 μL；LA-TaqDNA聚合酶2.5 U；模板5 μL，反应条件为：94℃预变性10 min；94℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物用经荧光染料染色的1%琼脂糖凝胶电泳检测，引物合成和DNA测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

2　结果与分析

2.1纤溶酶高产菌株的初筛

图1　纤溶酶生产菌的酪蛋白平板初筛结果Fig.1 Prescreening results of fibrinolysin producing strain with casein plate

纤溶酶生产菌的酪蛋白平板初筛结果见图1。由于纤溶酶可在酪蛋白平板上产生溶圈，因此将溶圈直径与菌落直径比值作为初筛指标。在8种样品中，豆豉2#，纳豆2#，纳豆4#与纳豆5#的菌落产生的溶圈直径与菌落直径比值较大，表明其产酶能力较高，可用于下一步复筛。

2.2纤溶酶高产菌株的复筛

取豆豉2#，纳豆2#，纳豆4#与纳豆5#菌株的发酵24 h和48 h后的上清液，采用纤维蛋白平板法检测纤溶酶酶活，结果见图2。结果表明，纳豆4#菌株在发酵24 h与48 h后产酶酶活均最高，分别达到了305.64 U/mL和483.72 U/mL，因此将其作为纤溶酶生产菌保藏并进行下一步鉴定。

图2　纤溶酶生产菌的纤维蛋白平板复筛结果Fig.2 Secondary screening results of fibrinolysin producing strain with fibrin plate

2.3菌株的形态学观察与生理生化特征鉴定

纳豆4#菌株的生理生化试验结果见表1。由表1可知，纳豆4#菌株呈杆状，生有芽孢，革兰氏染色为阳性，该菌株特性与枯草芽孢杆菌相似。

表1　纳豆4#菌株的生理生化特征鉴定结果Table 1 Physiological and biochemical characteristics of Natto 4#strain

2.4菌株的16S rDNA鉴定［14-15］

提取纳豆4#菌体细胞总DNA，利用细菌通用引物27F与1492R进行16S rDNA PCR扩增，电泳图谱见图3。直接测序结果表明，16S rDNA PCR扩增产物长度为1 398 bp。

图3　纳豆4#菌株16S rDNA扩增产物电泳图谱Fig.3 Electrophoretic graph of PCR product of Natto 4#strain

2.5菌株系统发育树的构建

利用上述同源性比较的检索结果，从中选取与纳豆4#菌株相似度较高的7株芽孢杆菌，从GenBank中下载其16S rDNA序列，使用Mega 5.1软件的Neighbor-Joining方法构建系统发育树，结果见图4。系统发育树结果表明，属于同一种、亲缘关系最近的菌株被聚为1个分支，其中纳豆4#菌株与Bacillus subtilisJCM1465聚为1个分支，与其他芽孢杆菌相距较远，表明纳豆4#菌株与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）亲缘关系最近。将测序结果与美国国家生物技术中心（national center of bioteehnology information，NCBI）中芽孢杆菌16S rDNA基因序列进行同源性比较，纳豆4#菌株的16S rDNA序列与枯草芽孢杆菌16S rDNA序列同源性达到100%。最后，综合形态学，生理生化试验，16S rDNA比对及系统发育树分析的结果，将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

图4　纳豆4#菌株的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of Natto 4#strain

3　结论

本研究采用酪蛋白平板法与纤维蛋白平板法两种方法结合，从市售纳豆与豆豉产品中分离筛选出一株高产纤溶酶生产菌，发酵48 h后，其粗酶活为483.72 U/mL，通过形态学、生理生化特征、16S rDNA序列鉴定与及系统发育树的分析，鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。本研究可为心脑血管疾病相关保健产品与新型溶栓药物的开发与工业化生产提供前期基础，具有良好的应用前景。

［1］梁春，葛均波.血栓性疾病：已知中的未知［J］.上海医学，2013，36（9）：739.

［2］张欣.新型口服抗凝药物治疗血栓栓塞性疾病进展［J］.天津医药，2013，41（10）：1014-1016.

［3］SUMI H，HAMADA H，TSUSHIMA H，et al.A novel fibrinolytic enzyme（nattokinase）in the vegetable cheese natto：A typical and popular soybean food in the Japanese diet［J］.Experientia，1987，43（10）：1110-1111.

［4］KUMADA K.Isolation ofBacillus subtilisnatto which shows high fibrinolytic activity［J］.Igakutu Seibutsug-aku，1993，126（6）：299-303.

［5］URANO T，IHARA H，UMEMURA K，et al.The profibrinolytic enzyme subtilisin NAT purified fromBacillus subtiliscleaves and inactivates plasminogen activator inhibitor type1［J］.J Biol Chem，2001，276（27）：24690-24696.

［6］向梅，吴思方，王伟平，等.豆豉纤溶酶产生菌的筛选及菌种鉴定［J］.微生物学杂志，2005，25（1）：21-24.

［7］刘柳，彭喜春.纳豆激酶与豆豉纤溶酶酶学性质比较研究［J］.中国酿造，2010，29（8）：88-90.

［8］高泽鑫，王常苏，黄勋，等.双菌混合发酵生产豆豉的条件优化［J］.中国酿造，2014，33（9）：49-52.

［9］彭勇，张义正.解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）DC-4产豆豉溶栓酶发酵条件的优化［J］.食品与发酵工业，2002，8（4）：19-23.

［10］李小丽.纳豆芽孢杆菌分离及纳豆激酶活性的研究［D］.合肥：安徽农业大学，2009.

［11］王艳艳，邓启华.纳豆激酶液体发酵条件优化的研究［J］.中国酿造，2013，32（12）：83-87.

［12］杨明，董超，史延茂，等.纤维蛋白平板法测定纳豆激酶方法的改进［J］.中国酿造，2008，27（7）：77-80.

［13］东秀株，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册［M］.北京：科学出版社，2001：69-75.

［14］WOESE C R.Bacterial evolution［J］.Microbiol Rev，1987，51：221-271.

［15］刘朝军，沈定霞.16S rDNA序列测定在细菌鉴定中的应用［J］.军医进修学院学报，2011，32（7）：774-776.

Screening and identification of a strain with high yield fibrinolytic enzyme

XUE Jian，WANG Huan，YIN Rui
（Jilin Agricultural and Science Technology College，Jilin132101，China）

As a kind of new thrombolytics，the fibrinolytic enzyme in traditional fermented soybean food has the advantages of high safety，quick effect，low cost，and production by liquid fermentation.A high fibrinolytic enzyme producing strain was screened from the commercial natto products. After fermentation for 48 h，the enzyme activity was 483.72 IU/ml.The strain was identified asBacillus subtiliswith the methods of morphology，physiological，biochemical characteristics，16SrDNA sequence and phylogenetic tree analysis.

fibrinolytic enzyme；screening；16S rDNA；identification

Q939.97

0254-5071（2016）09-0106-03doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.024

2016-04-10

吉林省教育厅十二五科学技术研究项目（2012308）；吉林市科技局杰出青年培养专项（2013625016）

薛健（1979-），男，讲师，博士，研究方向为微生物工程与代谢工程。