中和剂对大肠杆菌工程菌HBUT-L16发酵产L-乳酸的影响

文　瑶，周　玮，刘　枣，王永泽*，王金华

（湖北工业大学 发酵工程教育部重点实验室 工业发酵湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430068）

中和剂对大肠杆菌工程菌HBUT-L16发酵产L-乳酸的影响

文瑶，周玮，刘枣，王永泽*，王金华

（湖北工业大学 发酵工程教育部重点实验室 工业发酵湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430068）

该文对前期构建的产高光学纯度L-乳酸的大肠杆菌工程菌HBUT-L进行了耐乳酸钠的驯化，并对驯化前后菌株发酵产L-乳酸的中和剂进行了选择和对比。结果表明，经过28代驯化后的菌株HBUT-L16以Ca（OH）2作中和剂时发酵效果较NaOH为中和剂时效果好，L-乳酸产量、糖酸转化率及生产强度分别提高了6.6%、5.6%、44.4%。与驯化前菌株HBUT-L的发酵结果相比，HBUT-L16以Ca（OH）2为中和剂进行发酵时，乳酸产量提高了4.4%，糖酸转化率提高了2.8%，生产强度增加了26.71%；而以NaOH为中和剂时，对驯化前后菌株的发酵效果影响不大，由此推测耐乳酸钠的驯化主要通过提高工程菌对乳酸根的耐受性而非钠离子的耐受性，来提高L-乳酸的产量。

大肠杆菌工程菌；L-乳酸；驯化；中和剂

目前，L-乳酸及其衍生物广泛应用于食品行业和医药行业，而且L-乳酸作为生物降解材料聚乳酸的单体越来越受到人们的重视，极具应用前景。大肠杆菌（Escherichiacoli）具有遗传背景清楚、易于进行基因工程改造、发酵周期较短和营养要求简单等优点，近年来，在L-乳酸生产中扮演了重要角色［1-2］。

前期已构建成功一批大肠杆菌工程菌用于L-乳酸的发酵，并研究了不同中和剂对其发酵产乳酸的影响［3-5］。在此基础上，拟进一步通过耐乳酸盐的驯化，提高菌株对发酵产物的耐受性，达到提高发酵乳酸的产量、糖酸转化率及生产强度的目的。但高浓度乳酸盐除了乳酸根以外，还存在阳离子，因此在驯化大肠杆菌其耐受性时，到底是提高了菌株耐乳酸根的能力，还是提升了菌株耐阳离子的能力不容易判断。这个问题关系到乳酸发酵中和剂的选择，这是因为在乳酸发酵过程中，不同中和剂会带来一些不同浓度的离子而影响发酵。如以氨水作为中和剂时，发酵液中NH4+浓度积累到一定程度，就开始抑制菌体的生长及代谢产酸的能力［6］。研究表明，以Ca（OH）2为中和剂时，Ca2+的存在对菌体的生长有促进作用［7］，以NaOH作中和剂，会带来一定浓度的钠离子［8］。如能判断出驯化后菌株对离子的耐受性，无疑对中和剂的选择有较大的帮助。

本研究拟对大肠杆菌工程菌HBUT-L进行了耐乳酸钠的驯化后，再对驯化前后菌株发酵产L-乳酸的中和剂进行了选择和对比，以期了解乳酸钠驯化对大肠杆菌发酵产L-乳酸时中和剂的选择带来影响。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌株

实验菌株大肠杆菌（Escherchia coli）HBUT-L，为本实验室构建并保藏于-80℃冰箱。以D-乳酸工程菌HBUT-D为出发菌株［9］，敲除其D-乳酸脱氢酶基因，同时插入带有自身启动子序列的L-乳酸脱氢酶基因，具有良好的L-乳酸发酵特性［10］。

1.1.2培养基

乳酸钠驯化培养基：参照文献［11］配制NBS培养基，按实验设计添加0～14%的乳酸钠和20 g/L的葡萄糖。发酵种子培养基：含有20 g/L葡萄糖的NBS培养基。摇瓶发酵培养基：150 mL NBS培养基，40 g/L碳酸钙，70 g/L葡萄糖。

发酵培养基：3 L NBS培养基，100 g/L葡萄糖。

1.1.3主要试剂

蛋白胨（生化试剂）：上海盛思生化科技有限公司；酵母粉（生化试剂）：安琪酵母股份有限公司；氯化钠、碳酸钙、乳酸钠、Ca（OH）2、NaOH（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖（分析纯）：山东祥瑞药业有限公司；琼脂（生化试剂）：上海拜力生物科技有限公司；D-乳酸钠和L-乳酸钠（色谱级）：美国SIGMA-ALORICH公司；葡萄糖标准样：山东省科学院生物研究所。

1.2仪器与设备

7 L发酵罐：德国贝朗医疗有限公司；SBA-40D生物传感仪：山东省科学院生物研究所；e2695高效液相色谱：美国Waters公司。

1.3实验方法

1.3.1HBUT-L的适应性驯化及摇瓶验证

挑取活化好的平板单菌落4～6个接种至150 mL含有2%乳酸钠的驯化培养基的250 mL锥形瓶中，于37℃、200 r/min条件下培养24 h后转代培养，每代测菌体生物量（OD600nm），当连续数代OD600nm值变化较小时，按2%的接种量转接至150 mL含4%乳酸钠的新鲜驯化培养基中，继续传代培养，依此类推，逐渐将乳酸钠含量提高至12%，并在此浓度条件下反复驯化培养直至OD600nm值趋于平稳，对驯化后的菌株命名为HBUT-L16。

分别对HBUT-L和HBUT-L16进行摇瓶发酵。挑取LB平板上活化好的单菌落4～6个，接种至含有150 mL新鲜NBS培养基的250 mL锥形瓶中，37℃、200 r/min培养7～8 h后，获得种子液。按2%的接种量接种至摇瓶发酵培养基中，发酵条件为：37℃，200 r/min。定时取样，检测样品中菌体生物量（OD600nm值）、残留葡萄糖浓度、L-乳酸含量及其光学纯度。

1.3.2中和剂对HBUT-L发酵效果的影响

分别对驯化前的菌株和驯化后的菌株在7 L发酵罐中进行发酵。挑取LB平板上活化好的单菌落4～6个，接种至含有300mL新鲜NBS培养基的1L锥形瓶中，37℃、200 r/min培养7～8 h后，获得种子液。发酵罐中初始装液体积为3 L，接种量为10%。发酵条件为：37℃，200 r/min，中和剂分别采用3 mol/L Ca（OH）2和6 mol/L NaOH，通过自动流加中和剂的方式控制发酵液pH在7.0左右。定时取样，检测样品中菌体生物量（OD600nm值）、残留葡萄糖浓度、L-乳酸含量。

1.3.3测定方法

样品中菌体生物量（OD600nm值）、残留葡萄糖浓度、L-乳酸含量参照文献［10-11］的方法进行；发酵液中有机酸副产物乙酸、琥珀酸的测定按照参考文献［9-10］的方法进行。

2　结果与分析

2.1HBUT-L在乳酸钠中适应性驯化的结果

为了提高HBUT-L在较高浓度乳酸盐条件下的生长能力，采用一定浓度梯度的乳酸钠对其进行了长期的适应性驯化，驯化后的菌株命名为HBUT-L16。

表1　大肠杆菌HBUT-L在乳酸盐中的适应性驯化结果Table 1 Adaptive domestication results ofE.coliHBUT-L in lactate

本研究在对菌株HBUT-L进行传代培养时，逐渐提高乳酸钠的含量，来缓解乳酸根对大肠杆菌HBUT-L菌体生长的抑制。从表1的结果可知，驯化28代后的菌株HBUT-L16在12%乳酸盐含量条件下培养所得OD600nm值为0.48，与驯化前OD值相比有较大的降低。但与一些在乳酸根浓度在10%以上就停止生长的菌株［13］相比，经过28代驯化得到的菌株HBUT-L16具有较好的生长特性。

为了验证乳酸钠对HBUT-L的驯化效果，对驯化前后的菌株在摇瓶中的发酵结果进行了对比分析，结果如表2所示。

由表2可知，经过驯化，残糖由驯化前的10.23 g/L降低至3.34 g/L，乳酸产量提高了15.29%。

表2　驯化前后摇瓶发酵效果的比较Table 2 Results of fermentation in shake flask before and after domestication

2.2驯化前菌株在不同中和剂中的发酵效果

为了研究驯化前菌株在不同中和剂中的发酵效果，试验中分别采用3mol/LCa（OH）2和6mol/LNaOH作为中和剂对菌株HBUT-L进行发酵研究，发酵结果分别如图1、图2所示。

图1　菌株HBUT-L以Ca（OH）2为中和剂发酵动力学曲线Fig.1 Fermentation kinetic curve of strain HBUT-L using Ca（OH）2as neutralizer

从图1可以看出，以Ca（OH）2为中和剂进行L-乳酸发酵时，在发酵初期0～12 h，菌体以生长为主，12 h以后菌体生长迅速，发酵到24 h，菌体生长趋于缓慢；从糖耗来看，发酵初期0～12h，葡萄糖消耗较为缓慢，12 h后发酵液中葡萄糖含量急剧下降，34 h后未检测到残糖；与生长相对应，发酵到12 h，L-乳酸合成速率加快，发酵至32 h，乳酸产量为94.05 g/L。

图2　菌株HBUT-L以NaOH为中和剂发酵动力学曲线Fig.2 Fermentation kinetic curve of strain HBUT-L using NaOH as neutralizer

从图2可以看出，菌株HBUT-L以NaOH为中和剂发酵乳酸时，发酵初期0～4 h，菌体生长缓慢，4 h以后菌体快速生长，发酵到24 h，菌体生长进入稳定期；发酵4 h后葡萄糖消耗速率明显加快，24 h后葡萄糖消耗速率开始减慢，38 h达到发酵终点，残留葡萄糖仅为0.23 g/L；与菌体生长相对应，L-乳酸的产量在发酵4 h后就快速增加，发酵24 h后产量增加幅度变缓，乳酸最终产量为91.72 g/L。

2.3驯化后菌株在不同中和剂中发酵效果

为了研究驯化后菌株在不同中和剂的发酵效果，试验中分别采用3 mol/L Ca（OH）2和6 mol/L NaOH为中和剂对HBUT-L16进行发酵研究，发酵结果分别如图3、图4所示。

图3　菌株HBUT-L16以Ca（OH）2为中和剂发酵动力学曲线Fig.3 Fermentation kinetic curve of strain HBUT-L16 using Ca（OH）2as neutralizer

从图3可以看出，菌株HBUT-L16以Ca（OH）2为中和剂进行L-乳酸发酵时，发酵初期0～12 h，菌体生长较为缓慢，12h以后菌体生长迅速，发酵到24h，菌又体生长趋于缓慢；糖耗和菌体生长的趋势基本相关，发酵12 h后葡萄糖消耗急剧增加，发酵到28 h，已检测不到发酵液中的残糖；L-乳酸的合成也和菌体的生长同步，12 h以后乳酸产量增长迅速，28 h达到发酵终点，乳酸产量98.23 g/L。

图4　菌株HBUT-L16以NaOH为中和剂发酵动力学曲线Fig.4 Fermentation kinetic curve of strain HBUT-L16 using NaOH as neutralizer

由图4可以看出，菌株HBUT-L16以NaOH为中和剂发酵乳酸时，发酵到8h，菌体就进入生长对数期，发酵到24 h，菌体生长趋于平稳；葡萄糖消耗在前8 h也较为缓慢，8 h后消耗开始快速增加；同样，乳酸生成与菌体生长存在相关性，进入对数生长后（8 h后）乳酸产量不断增加，一直发酵到38 h，加碱停止，发酵结束，残糖为0.23 g/L，乳酸产量达到92.19 g/L。

2.4乳酸钠驯化对中和剂选择的影响

为了研究乳酸钠驯化对中和剂选择的影响，对驯化前后菌株利用不同中和剂的发酵结果进行了对比。

表3　菌株HBUT-L和菌株HBUT-L16利用不同中和剂发酵效果的比较Table 3 Fermentation comparison between strains HBUT-L and HBUT-L16 with different neutralizers

由表3可知，驯化前菌株HBUT-L或驯化后的菌株HBUT-L16在以Ca（OH）2作中和剂时，L-乳酸产量、糖酸转化率及生产强度等指标均比NaOH作中和剂时要高。HBUT-L16以Ca（OH）2为中和剂时，L-乳酸产量、糖酸转化率及生产强度分别为98.23 g/L、98.66%和3.51 g/（L·h），比以NaOH作为中和剂的发酵结果相比，分别提高了6.6%、5.6%、44.4%。

究其原因，可能在于以下两点：首先，以Ca（OH）2作为中和剂时，能为菌体生长提供Ca2+，使菌体快速进入生长对数期，缩短发酵周期，因而能获得较大的生产强度［3.51g/（L/h）］。而以NaOH作为中和剂时，发酵罐中OD600nm值达到4.67，菌体密度相对较低，发酵周期延长了10 h，大大影响了乳酸的生产强度。其次，从理论进行分析，1分子的Ca（OH）2可以中和2分子的乳酸，而1分子的NaOH只能中和1分子的乳酸。因此，Ca（OH）2相对NaOH来说具有更强的中和能力，生产相同量的L-乳酸，中和剂Ca（OH）2的用量相对较少，那么发酵液中的渗透压小，更适合菌体的生长和发酵。

由表3还可知，驯化后的菌株，在以Ca（OH）2作中和剂时，相比驯化前的菌株，乳酸产量提高了4.4%，糖酸转化率提高了2.8%，生产强度增加了26.71%；而以NaOH为中和剂进行发酵时，驯化前后菌株的发酵结果相差不大。这可能是由于以NaOH作为中和剂进行发酵时，生成的钠盐均能完全溶解，导致发酵液中渗透压偏高，因此发酵液中高浓度可溶物质（如钠盐）的存在对发酵有不利影响［14-15］，菌体生长和发酵都比较缓慢。虽然通过乳酸钠的驯化，驯化后菌株产L-乳酸能力未见大的提升，可能原因是驯化后菌株钠离子耐受性仍未提高。而驯化后菌株以Ca（OH）2为中和剂进行发酵时，与驯化前相比表现出较好的发酵性能。因此，采用乳酸钠对菌体进行长期驯化，主要是提高了菌体对乳酸根的耐受性。

3　结论

菌株HBUT-L经过28代驯化，摇瓶中乳酸产量提高了15.29%。不论是驯化前的菌株HBUT-L还是驯化后的菌株HBUT-L16，以Ca（OH）2作中和剂时，L-乳酸产量、糖酸转化率及生产强度等指标均比氢氧化钠作中和剂时要高。菌株HBUT-L16以Ca（OH）2为中和剂时，乳酸产量、糖酸转化率和生产强度分别提高了6.6%、5.6%、44.4%。

与驯化前菌株HBUT-L的发酵结果相比，菌株HBUT-L16以Ca（OH）2为中和剂进行发酵时，乳酸产量提高了4.4%，糖酸转化率提高了2.8%，生产强度增加了26.71%；而以NaOH为中和剂时，对驯化前后菌株的发酵效果影响不大。结果表明，采用乳酸钠对菌体进行长期驯化，主要是提高了菌体对乳酸根的耐受性。

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Effects of neutralizers on L-lactic acid yield byEscherichia coliHBUT-L16 fermentation

WEN Yao，ZHOU Wei，LIU Zao，WANG Yongze*，WANG Jinhua
（Hubei Cooperative Innovation Center for Industrial Fermentation，Key Laboratory of Fermentation Engineering Ministry of Education，Hubei University of Technology，Wuhan 430068，China）

A previously engineeredEscherichia coliwith high yield of optical purity L-lactic acid was domesticated to resist sodium lactate，and neutralizer that evolved in strain fermentation for L-lactic acid production before and after domestication was selected and compared.Results showed that the strain HBUT-L16 which was adaptively evolved for 28 generation had a better fermentation effect with Ca（OH）2as neutralizer comparing with that of NaOH as neutralizer，the L-lactic acid yield，sugar-acid conversion rate and productivity increased 6.6%，5.6%and 44.4%，respectively.Comparing with the results of undomesticated strain HBUT-L，the strain HBUT-L16 produced 4.4%more L-lactic acid，2.8%more conversion rate and 26.71%more productivity in the fermentation with Ca（OH）2as neutralizer.While there was no obvious influence on the results using NaOH as neutralizer.So it suggested that the L-lactic acid yield was improved mainly by improving the tolerance of engineered strain for lactate but not for Na+.

engineeredEscherichia coli；L-lactic acid；domestication；neutralizer

Q815

0254-5071（2016）09-0043-04doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.010

2016-04-16

湖北省自然科学基金项目（No.2011CDB076）；湖北省教育厅项目（No.B20121402）；国家级本科教学质量与教学改革工程项目（No.201210500032）

文瑶（1991-），女，硕士研究生，研究方向为发酵工程。

王永泽（1976-），男，副教授，博士，研究方向为生物质能利用与酶工程。