核桃粕发酵乳菌种筛选及发酵条件优化研究

张洪礼，徐素云，彭邦远，丁筑红*

（贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550000）

核桃粕发酵乳菌种筛选及发酵条件优化研究

张洪礼，徐素云，彭邦远，丁筑红*

（贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550000）

该试验对乳酸菌发酵核桃粕乳的不同菌株进行筛选，通过pH值、酸度及感官评定分析，从9株乳酸菌中筛选出嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）两株优良菌种。研究两株乳酸菌的复配比例，并与传统发酵剂发酵的核桃粕乳进行品质对比。结果表明，以嗜酸乳杆菌：植物乳杆菌（1∶1）接种发酵后得到的发酵核桃粕发酵乳综合品质最佳，其感官评分90分，氨基酸态氮含量57.0 mg/L，活菌总数7.35×107CFU/mL，经发酵后的营养价值明显优于传统发酵剂发酵的核桃粕乳。

发酵剂；核桃粕乳；嗜酸乳杆菌；植物乳杆菌

核桃（Juglans regialL.）是传统经济作物，我国核桃种植面积与产量均居世界首位，主要分布在云南、贵州、河北等地区，其中最具代表性的品种有贵州铁核桃、河北核桃、山西汾阳核桃等［1］。核桃具有丰富的营养物质，核桃仁中蛋白质含量15%左右，脂肪含量约63%，且核桃油中的不饱和脂肪酸大多是人体必需的不饱和脂肪酸，如油酸、亚油酸、亚麻酸和花生烯酸占核桃油总量的90%［2］。核桃仁具有药食同源的特性，有极高的营养保健和药理作用，且其营养易于吸收，对哮喘病人十分有利，因此核桃被历代养生学家和医学家视为益寿精品［3］。

核桃粕是核桃榨油后的副产物，蛋白质含量丰富，可达到53.89%左右［4］，含18种氨基酸且人体必需的8种氨基酸配比合理，接近联合国粮农组织（food and agriculture organization，FAO）和世界卫生组织（worldhealthorganization，WHO）规定的标准，加之脂肪含量低，完全符合老年人对食品“四足四低”的要求。目前核桃粕的开发主要用于提取生物活性肽，具有调节高血压、增强抗氧化能力、缓解疲劳等功能［5-8］。在产品开发方面，其主要用于生产高蛋白核桃粉直接饮用或作为半成品添加在面包、蛋糕等各类糕点中，或生产低脂核桃乳或复合类低脂核桃乳，发酵乳有报道采用植物乳杆菌、嗜热链球菌等菌种进行发酵［9-11］。本研究多株食用乳酸菌种中筛选出最适菌种发酵，以期提高核桃粕发酵乳的营养及风味品质，以满足市场各类人群的需要。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

核桃粕：市售饱满、无损坏变质核桃，经压榨去油后制得；RB-高脂乳花生奶稳定剂：上海健鹰食品科技研究所；无水乙醚、乙醇、丙酮、异辛烷：天津市赋予精细化工有限公司；氯化钠、硫代硫酸钠、碘化钾、氢氧化钠、硫酸铜、硫酸钾：成都金山化学试剂有限公司；硫酸、盐酸、硼酸：重庆联瑞化工有限公司；千里香酚蓝、冰乙酸：成都科龙化工试剂厂；淀粉：徐州人和居食品厂。所用试剂均为分析纯。

嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、食果糖乳杆菌（Lactobacillus fructivorans）、双发酵乳杆菌（Double fermentationofLactobacillus）、短乳杆菌（Lactobacillusbrevis）、戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、乳酸片球菌（Pedicoccus acidilacticii）、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）、德氏乳杆菌乳酸亚种（Lactobacillus delbrueckiisubsp.lactis）：贵州轻化工中心；保加利亚乳杆菌（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）的复合菌株：中国普通微生物菌种保藏管理中心。

平板计数琼脂培养基：北京陆桥公司；MRS液体培养基、MRS琼脂培养基：实验室自制。

1.2仪器与设备

HH-S26六孔恒温水浴锅：上海梅香仪器有限公司；TU-1810型紫外-可见光分光光度计：北京普析通用仪器公司；MLS-3780MLS-3780高压蒸汽灭菌锅：杭州亚旭生物科技有限公司；LD4-2型离心机：北京医用离心机厂；SKD-800半微量凯式定氮仪：上海旦鼎国际贸易有限公司；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司；SHP-250型智能生化培养箱：上海兴都仪器设备有限公司。

1.3方法

1.3.1发酸乳加工工艺流程与操作要点

核桃粕汁的制备［12］：核桃粕与水以1∶8质量比，85℃浸泡30 min。

磨浆、过滤：采用160目筛网过滤得到核桃粕汁，加入0.2%复合稳定剂后调配均质。

灭菌：121℃恒温15 min杀菌，冷却至40℃以下，得到核桃粕汁。

菌株的活化与驯化［13］：将9株菌种进行活化复壮，以3%的接种量（V/V）接种到MRS培养基，培养条件为（37± 1）℃，以24 h内达到对数生长期（活菌数＞106CFU/mL）停止。将活化的9株菌种，分别在核桃乳与MRS培养基体积比0∶10、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、10∶0混合培养基中依次驯化，使菌株在100%样液中能够很好的生长（活菌数＞106CFU/mL）。

接种［14］：将驯化好的9株乳酸菌液，以3%的接种量（V/V）接种到装有核桃粕汁样液的锥形瓶中，

发酵：在42℃条件下培养发酵，分析发酵品质变化。

单菌株复配的研究：将实验筛选出的优良菌株复配接种培养，通过理化指标与感官分值比较，筛选最佳复配比。

传统发酵剂（保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的复合菌株）与实验复合菌株均在接种量3%、培养温度42℃、发酵时间6 h的条件下制备发酵核桃乳，比较发酵液的感官指标和理化指标［9］。

1.3.2分析方法

感官品质评定：邀请10名专家及工作人员对发酵核桃粕乳及发酵核桃粕复合乳的感官品质进行分析满分100分，核桃粕发酵乳感官评定标准见表1。

表1　核桃粕发酵乳感官评定标准Table 1 Sensory evaluation standard of fermented walnut dregs milk

感官评价模糊数学模型的建立［15］：以色泽、香气、滋味、体态为因素集，以好、较好、一般、差为评语集，根据感官评定结果，建立4个单因素评价矩阵，用模糊数学评价方法对其进行分析。

（1）建立评判集

对各菌种发酵得到的核桃粕乳样液分别编号后，根据表1对发酵核桃粕乳的品质要求进行模糊综合评判，建立评判集。

因素集U=｛色泽u1，香气u2，滋味u3，组织状态u4｝；

评语集V=｛好，较好，一般，差｝；

（2）权重的确定

权重集X=｛0.25，0.25，0.30，0.20｝，即色泽25分，香气25分，滋味30分，组织状态20分，共100分。

（3）模糊关系综合评判集

模糊关系综合评判集Y=X×R，其中X为权重集，R为模糊矩阵。

加权综合性评分法［16］：取实验的考察指标为因素，则因素集U=｛U1、U2｝，其各因素隶书函数，如下：

选取评价函数为Di=a1U1i+a2U2i式中a1，a2权重系数。

1.3.3理化及微生物指标的测定

氨基酸态氮含量：电位滴定法；可溶性固形物含量：折光计法；pH值：参照GB/T 9724—2007《化学试剂pH值测定通则》中方法；酸度：参照GB 541334—2010《乳和乳制品酸度的测定》中方法。

菌落总数、大肠菌群、致病菌检验：参照GB/T4789.21—2003《食品卫生微生物学检验冷冻饮品、饮料检验》；乳酸活菌数的测定：参照GB 4789.35—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》。

2　结果与分析

2.1单菌株发酵pH、酸度变化结果分析

图1　不同菌种发酵核桃粕发酵乳pH值变化曲线Fig.1 pH change curve of fermented walnut dregs milk with different strains

图2　不同菌种发酵核桃粕发酵乳酸度变化曲线Fig.2 Acidity change curve of fermented walnut dregs milk with different strains

由图1、图2可知，不同菌种发酵核桃粕乳的pH值与时间成负相关，其中短乳杆菌的pH变化缓慢，其他8株菌株的pH值降低变化趋势相似；不同菌种发酵酸度变化与时间大致呈正相关，其中短乳杆菌的产酸能力较差，而嗜酸乳杆菌杆菌在6 h时产酸能力最强，其他7株菌株的产酸能力的增强基本趋于一致。各菌种间pH和酸度差异显著（P＜0.05）。

2.2不同菌株核桃粕发酵乳感官品质的模糊数学分析结果

2.2.1感官评定结果及建立模糊矩阵

10名评价员对9种不同菌种的核桃粕发酵乳样液进行感官评定，结果见表2。

表2　单菌发酵核桃粕发酵乳样液感官评定结果Table 2 Sensory evaluation results of fermented walnut dregs milk with single strain fermentation

由表2可知，以编号为1的发酵核桃粕乳样液为例，可建立色泽、香气、滋味和组织状态，4个单因素的模糊评价矩阵：A色泽=［0.5 0.3 0.2 0.0］，A香气=［0.5 0.4 0.1 0.0］，A滋味=［0.5 0.5 0.0 0.0］，A组织状态=［0.4 0.4 0.2 0.0］。把上述对1号样品的4个单因素评价结果写成一个模糊矩阵，

同理可得1、2、3、4、5、6、7、8、9样品的模糊矩阵分别为R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9。

2.2.2确定模糊关系综合评判集

其中Y11=（0.25∧0.5）∨（0.25∧0.5）∨（0.3∧0.5）∨（0.2∧0.4）=0.25∨0.25∨0.3∨0.2=0.3，经归一化处理后得Y1=（0.375，0.375，0.25，0.00）同理得：

Y2=（0.300，0.300，0.300，0.100），Y3=（0.273，0.273，0.273，0.182）

基于前文分析，从深层原则与基础理念看，近代以来西方社会管理的基本要素或基本原则主要有两个：一是个人主义，二是理性主义。

Y4=（0.273，0.273，0.273，0.182），Y5=（0.316，0.316，0.263，0.500）

Y6=（0.375，0.375，0.250，0.000），Y7=（0.300，0.300，0.300，0.100）

Y8=（0.273，0.273，0.273，0.182），Y9=（0.273，0.273，0.273，0.182）

2.2.3模糊综合评判总分

设定感官特殊性：好为100分，较好为80分，一般为60分，较差为40分，可建立感官特殊性数集V=（100，80，60，40），则样品的模糊综合评判总分为：T=Y×V。得到1号核桃粕乳：T1=（0.375，0.375，0.25，0.00）×（100，80，60，40）=0.375× 100+0.375×8+0.25×60+0.00×40=82.50分；同理得编号为2、3、4、5、6、7、8、9的发酵核桃粕乳样液模糊综合评判结果为：T2=80.00分，T3=72.80分，T4=72.80分，T5=76.86分，T6= 82.50分，T7=80.00分，T8=72.80分，T9=72.80分。由此可选出嗜酸乳杆菌与植物乳杆菌发酵的核桃乳样总分较高，因此选择这两种菌进行复合菌株配比试验。

2.3复合菌株最佳配结果分析

2.3.1感官评定结果

表3　复合菌发酵核桃粕发酵乳样液感官评定结果Table 3 Sensory evaluation results of fermented walnut dregs milk with multi-strains fermentation

根据表3数据，分别对10、11、12样品建立模糊矩阵为R10、R11、R12。

2.3.2确定模糊关系综合评判集

对其进行归一化处理后得Y10=（0.500，0.500，0.000，0.000），同理得Y11=（0.316，0.316，0.263，0.105），Y12=（0.300，0.300，0.300，0.100）。

2.3.3模糊综合评判总分

设定感官特殊性：好为100分，较好为80分，一般为60分，较差为40分，可建立感官特殊性数集V=（100，80，60，40），则样品的模糊综合评判总分为：T=Y×V。得到10号核桃粕乳样液的总分为：T10=（0.500，0.500，0.000，0.000）×（100，80，60，40）=0.500×100+0.500×80+0.000×60+0.000×40=90.00

同理得编号为11、12核桃粕乳样液模糊综合评判结果为：T11=76.86分，T12=76.00分。综合以上模糊综合评判结果可知，单一菌种嗜酸乳杆菌T1=82.50分，植物乳杆菌T6= 82.50分，得到嗜酸乳杆菌与植物乳杆菌的单一菌种和复合菌种发酵的核桃粕乳样液的感官质量优劣顺序为：T10＞T1=T6＞T11＞T12。

2.3.4发酵核桃粕乳的理化指标

表4　复合菌发酵核桃粕发酵乳的理化指标Table 4 Physicochemical indexes of fermented walnut dregs milk with multi-strains

由表4可知，在相同发酵条件下，嗜酸乳杆菌与植物乳杆菌接种比例为1∶1情况下，发酵品质较好，可溶性固形物为7.6%，酸度为80°T，氨基酸态氮含量为57.0 mg/L。通过发酵核桃粕乳验证实验，结果得出产品的感官评分最高为90分。

2.4不同发酵剂菌种发酵产品比较

根据感官评定结果并结合模糊数学分析方法最终得出：传统发酵核桃乳的感官评分为85.80分，本研究开发的发酵核桃乳的感官评分为90分，即本研究开发的核桃粕乳在感官程度上优于传统发酵剂发酵核桃粕乳；由表5可知，本研究开发的核桃粕乳的可溶性固形物含量为7.6%、氨基酸态氮含量为57.0mg/L、活菌总数为7.35×107CFU/mL，均优于传统发酵剂发酵核桃粕乳；表明本研究筛选的发酵菌株组合设计有更强的生长活力，菌落总数、可溶性固形物、氨基酸态氮、膳食纤维等物质含量得到提高。

表5　传统发酵和试验核桃粕发酵乳的理化指标比较Table 5 Physicochemical indexes comparison of fermented walnut dregs milk by traditional and experimental fermentation

3　结论

通过对9株乳酸菌及复合菌株的发酵特性进行分析和筛选。结果表明：发酵核桃粕乳最佳复合发酵菌株为嗜酸乳杆菌/植物乳杆菌（1∶1），接种量3%本研究开发的核桃粕发酵乳感官评分90分，可溶性固形物含量7.6%，酸度80°T，氨基酸态氮57.0 mg/L，活菌总数7.35×107CFU/mL，膳食纤维含量5.43%。通过对核桃粕发酵乳的最佳发酵剂进行筛选优化，获得新型核桃粕乳发酵产品，可进一步提高核桃的综合开发利用水平，提高核桃粕的食用价值，满足现阶段人们对营养高品质蛋白产品的需求。

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Strains screening and fermentation condition optimization for fermented walnut dregs milk

ZHANG Hongli，XU Suyun，PENG Bangyuan，DING Zhuhong*
（School of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550000，China）

The paper focused on screening lactic acid bacteria for walnut dregs milk fermentation.According to pH and acid determination and sensory evaluation analysis，Lactobacillus acidophilusandLactobacillus plantarumwere the optimal strains among the nine lactic acid bacteria.The compound proportion of the two strains of lactic acid bacteria was studied and the quality of walnut dregs milk was compared with the one fermented by traditional fermentation starter.The results showed thatL.acidophilusandL.plantarumratio 1∶1 exhibited optimal comprehensive quality for fermented walnut dregs milk，the sensory evaluation score was 90，amino acid nitrogen was 57.0 mg/L，bacteria count was 7.35×107CFU/ml，and the nutritional value of the multi-strains fermented milk was superior to those fermented with traditional fermentation starter.

fermentation starter；walnut dregs milk；Lactobacillus acidophilus；Lactobacillus plantarum

TS201.3

0254-5071（2016）09-0180-05doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.041

2016-04-15

黔科合重大专项（［2011］6011号）

张洪礼（1991-），男，硕士研究生，研究方向为食品加工。

丁筑红（1966-），女，教授，硕士，研究方向为农产品贮藏加工与综合利用。