佐剂关节炎大鼠血管新生COX—2、PI3K、AKT与细胞因子相关性研究

范为民　李艳　俞志超　叶玲梅

【摘要】 目的：观察佐剂关节炎大鼠环氧化酶-2（COX-2）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（AKT）的表达，以及其与白细胞介素-6（IL-6）、大鼠白细胞介素-10（IL-10）、血管内皮生长因子（VEGF）细胞因子的关系。方法：将20只大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常对照组（NC组）、模型对照组（MC组），每组10只。MC组每只大鼠右后足趾皮内注射弗氏完全佐剂0.1 ml，复制佐剂关节炎大鼠模型，NC组每只大鼠右后足趾皮内注射蒸餾水0.1 ml，两组均给药18 d。结果：与NC组比较，MC组足肿胀率、关节炎指数均明显升高，差异均有统计学意义（P<0.01）；MC组的IL-6、VEGF指标也均明显升高，而IL-10指标明显下降升高，差异均有统计学意义（P<0.01）；MC组的COX-2、PI3K、AKT指标均明显升高，差异均有统计学意义（P<0.01）；MC组大鼠COX-2与IL-6、VEGF呈正相关，与IL-10呈负相关；PI3K与IL-6、VEGF呈正相关，与IL-10呈负相关；AKT与IL-6、VEGF呈正相关。结论：COX-2、PI3K、AKT与IL-6、IL-10、VEGF细胞因子密切相关。

【关键词】 类风湿关节炎； 环氧化酶-2； 磷脂酰肌醇3-激酶； 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶； 血管新生

中图分类号 R331.32 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2016）6-0146-02

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2016.6.081

类风湿关节炎（RA）是一种以滑膜增生、关节破坏为主要特征的自身免疫系统疾病。滑膜炎主要病理表现为炎性细胞浸润和血管增生。近些年，研究证实PI3K/AKT通路参与RA滑膜血管增生病变[1]。本研究采用酶联免疫吸附法（ELISA）技术，检测佐剂关节炎大鼠血管新生相关的COX-2、PI3K、AKT的变化，研究其与类风湿关节炎IL-6、IL-10、VEGF等因子之间的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠20只，体重（200±20）g，由上海杰思捷实验动物有限公司提供，许可证号码：SCXK（沪）2013-0006。

1.2 药品及试剂

弗氏完全佐剂（美国Sigma公司生产），蒸馏水（弋矶山医院中心实验室提供），IL-6试剂盒、IL-10试剂盒、VEGF试剂盒、COX-2试剂盒、PI3K试剂盒、AKT试剂盒（武汉华美生物工程有限公司提供）。

1.3 实验仪器

离心机（安徽嘉文仪器有限责任公司），电热恒温箱（上海三发科学仪器有限公司），洗板机（雷杜生命科学股份有限公司），漩涡混合器（其林贝尔仪器制造有限公司），酶标仪（雷杜生命科学股份有限公司）。

1.4 造模方法

将20只大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常对照组（NC组），模型对照组（MC组），每组10只。MC组每只大鼠右后足趾皮内注射弗氏完全佐剂0.1 ml，复制佐剂关节炎大鼠模型，NC组每只大鼠右后足趾皮内注射蒸馏水0.1 ml，两组均给药18 d。

1.5 指标检测

1.5.1 大鼠足肿胀率检测 于致炎前、致炎后应用排水法分别测定每只大鼠右后足容积，并计算出大鼠足肿胀率[肿胀率（%）=（致炎后足容积-致炎前足容积）/致炎前足容积×100%]。

1.5.2 大鼠关节炎指数检测 于致炎前、致炎后计算大鼠关节炎指数：采用5级评分法，四肢关节炎指数之和代表每只大鼠的关节炎指数，积分越高，关节症状越严重，最高分值为16分。评分标准：0分，关节正常无红肿；1分，趾关节红肿；2分，趾关节和足趾肿胀；3分，踝关节以下的足爪肿胀；4分，包括踝关节在内的全部足爪肿胀、关节严重变形[2]。

1.5.3 大鼠IL-6、IL-10、VEGF、COX-2、PI3K、AKT指标检测 于实验结束后，大鼠腹主动脉取血，严格按照试剂盒要求，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测大鼠IL-6、IL-10、VEGF、COX-2、PI3K、AKT指标水平。

1.6 统计学处理

采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，比较采用t检验；非正态分布数据采用秩和检验；相关性分析采用多元回归相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠足肿胀率和关节炎指数比较

给药前，两组大鼠足肿胀率、关节炎指数比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；给药后，MC组足肿胀率、关节炎指数均明显高于NC组，差异均有统计学意义（P<0.01），详见表1。

2.2 两组大鼠IL-6、IL-10、VEGF比较

给药后，MC组的IL-6、VEGF指标均明显高于NC组，差异均有统计学意义（P<0.01）；而IL-10指标明显低于NC组，差异有统计学意义（P<0.01），详见表2。

2.3 两组大鼠COX-2、PI3K、AKT比较

给药后，与NC组比较，MC组的COX-2、PI3K、AKT指标均明显升高，差异均有统计学意义（P<0.01），详见表3。

2.4 MC组大鼠COX-2、PI3K、AKT与IL-6、IL-10、VEGF相关性分析

MC组大鼠COX-2与IL-6、VEGF呈正相关，与IL-10呈负相关；PI3K与IL-6、VEGF呈正相关，与IL-10呈负相关；AKT与IL-6、VEGF呈正相关，详见表4。

3 讨论

RA滑膜血管新生是滑膜炎症的主要病理特点和病理结果之一，是造成关节破坏的重要原因，防治血管新生成为RA治疗的主要靶点[3]。

IL-6主要由单核或巨噬细胞产生的单核因子，起促炎作用。IL-10主要由T细胞产生的淋巴因子，起抑炎作用。正常情况下，二者的动态平衡是维持机体正常免疫功能的必要条件。但是当IL-6产生过高，或IL-10产生相对过低，机体正常免疫功能相对平衡就被打破，机体就会出现异常，从而导致RA等免疫性疾病的发生。VEGF是一种糖基化分泌性多肽因子，作用于滑膜血管内皮，刺激血管内皮细胞分裂、增殖，增加RA微血管通透性，导致RA血管新生形成和滑膜炎症、滑膜血管翳程度的加重[4]。因此，IL-6和IL-10动态不平衡及VEGF过度表达对滑膜血管新生及RA病情加重有重要影响。COX-2是环氧化酶（COX）的亚型，COX-2的选择性抑制剂可以减轻关节炎的新生血管形成[5]。PI3K、AKT是血管生成的重要调节因子[6-7]，众多研究结果表明，PI3K/AKT信号通路与RA的滑膜细胞增殖、血管新生有重要关系[8-11]。

本研究结果显示，MC组足肿胀率、关节炎指数均明显高于NC组，差异均有统计学意义（P<0.01）；MC组的IL-6、VEGF指标明显升高，而IL-10指标明显下降升高，差异均有统计学意义（P<0.01）；MC组的COX-2、PI3K、AKT指标明显升高，差异均有统计学意义（P<0.01）；MC组大鼠COX-2与IL-6、VEGF呈正相关，与IL-10呈负相关；PI3K与IL-6、VEGF呈正相关，与IL-10呈负相关；AKT与IL-6、VEGF呈正相关。研究结果证实，血管新生相关的COX-2、PI3K、AKT与IL-6、IL-10、VEGF细胞因子有密切相关。

参考文献

[1]张晓军，刘健，万磊，等.佐剂关节炎大鼠滑膜血管新生与PTEN/PI3K/AKT信号传导通路的关系[J].中国骨伤，2015，28（1）：71-74.

[2] Stenmark K R，Fagan K A，Frid M G.Hypoxia-induced pulmonary vascular remodeling： cellular and molecular mechanisms[J].Circ Res，2006，99（7）：675-691.

[3] Rabquer B，Koch A E.NK4 therapy：a new approach to target angiogenesis and inflammation in rheumatoid arthritis[J].Arthritis Res Ther，2013，15（5）：119.

[4] Hah Y S，Koh Y J，Lim H S，et al.Double antiangiogenic protein，DAAP，targeting vascular endothelial growth factor-A and angiopoietins attenuates collagen-induced arthritis[J].Arthritis Res Ther，2013，15（4）：R85.

[5] Evans R.Anti arthritic drugs-SMi conference：dual inhibitors[J].Idrugs the Investigational Drugs Journal，2003，6（6）：552-554.

[6]赵婧，屈艺，母得志.PTEN/PI3K/AKT信号节点与血管生成研究進展[J].广东医学，2010，31（19）：2595-2597.

[7]王汉琴，姜宗来.PI3K/Akt信号通路与血管重建[J].郧阳医学院学报，2007，26（5）：320-324.

[8] Wu T，Mohan C.The AKT Axis as a Therapeutic Target in Autoimmune Diseases[J].Endocrine Metabolic and Immune Disorders Drug Targets，2009，9（2）：145-150.

[9]张晓军.基于PTEN/PI3K/AKT信号通路探讨新风胶囊改善佐剂关节炎大鼠滑膜血管新生的机制[D].武汉：湖北中医药大学，2014.

[10]阮丽萍，刘健，葛瑶，等.骨关节炎大鼠软骨PI3K/Akt-mTOR及Beclin-1自噬通路的表达及相关性分析[J].华中科技大学学报：医学版，2015，44（4）：429-433.

[11]郑振中.CD151基因转移对PI3K/Akt/eNOS信号转导和血管新生影响的研究[D].武汉：华中科技大学，2007.

（收稿日期：2015-10-09）