发酵低醇西瓜果酒产香酵母的分离筛选及香气成分分析

申光辉，黎梅，王玥，杨红霞，唐倩，刘小英，张志清

(四川农业大学 食品学院，四川 雅安，625014)



发酵低醇西瓜果酒产香酵母的分离筛选及香气成分分析

申光辉*，黎梅，王玥，杨红霞，唐倩，刘小英，张志清

(四川农业大学 食品学院，四川 雅安，625014)

为获得适宜低醇西瓜果酒发酵的酵母菌株，以嗅闻香气和总酯产量为指标，从传统白酒酒曲中分离筛选获得5株产香酵母。通过菌株形态、生理生化特征，结合26SrRNA序列分析，将菌株Z133鉴定为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)，菌株Z2、Z31、Z32和Z43鉴定为扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)。菌株Z133可产浓郁的果香气味，对糖、SO2及乙醇均有良好的耐受性，可发酵西瓜汁获得乙醇体积分数5.6%的低醇西瓜果酒。采用顶空固相微萃取-气质联用法分析发现，酒体中醇类和酯类香气成分种类和相对含量高于未发酵西瓜汁，主要香气成分苯乙醇、乙酸香叶酯和乙酸异戊酯的相对含量分别为25.65%、6.41%和3.93%。结果表明，从酒曲获得的产香酵母菌株Z133在低醇西瓜果酒发酵中具有一定的应用价值。

产香酵母；低醇西瓜果酒；香气成分；顶空固相微萃取

西瓜(Citrullus lanatusThunb.)瓤甜多汁，富含糖类、有机酸、维生素等营养功能成分，深受消费者喜爱。由于产期集中、不耐贮存，常以鲜食为主。利用西瓜汁发酵果酒是缓解西瓜滞销问题，提高产品附加值的有效途径。风味淡薄是目前大部分果酒生产中迫切需要解决的问题[1]。发酵菌种是影响果酒口感风味的重要因素之一，而目前西瓜果酒多用葡萄酒酵母发酵[2]，筛选适合西瓜果酒发酵的优良酵母菌种的研究工作开展较少，且多以菌株产乙醇能力为指标[3]，忽视了菌种的发酵产香性能对果酒风味的积极影响。产香酵母属于可产醇、醛、酯等多种芳香物质的非酿酒酵母，能够积极改变酒体的化学成分，对酒的感官风味品质有特别的贡献，可改善传统酿酒酵母酿制的果酒风味，在果酒生产中应用潜力巨大[4-11]。酒曲是我国传统白酒酿造的发酵生香剂，蕴含着产香酵母在内的多样化酿酒功能菌资源[12-14]。本实验从酒曲中分离筛选适于低醇西瓜果酒发酵的产香酵母，进行菌株分类鉴定和发酵性能测定，并检测发酵低醇西瓜果酒香气成分，以评价该菌株用于发酵低醇西瓜果酒的可行性。

1　材料与方法

1.1材料

酒曲：中温曲和中高温成熟曲，由四川省泸州市某酒厂提供。西瓜：市售成熟西瓜。

1.2培养基

麦氏培养基(g/L)：葡萄糖1.0，氯化钾1.8，酵母膏2.5，醋酸钠8.2，pH自然，115 ℃灭菌15min。YPD培养基(g/L)：葡萄糖20.0，蛋白胨20.0，酵母膏10.0，琼脂15.0，pH6.0，115 ℃灭菌15min。PDA培养基(g/L)：马铃薯(去皮)200.0，葡萄糖20.0，琼脂15.0，pH自然，121 ℃灭菌20min。豆芽汁培养基：取黄豆芽200.0g加适量水煮沸30min，纱布过滤得豆芽汁，加葡萄糖20.0g溶解，补水至1 000mL，121 ℃灭菌15min[10]。西瓜汁培养基：鲜西瓜取瓤榨汁过滤，用蔗糖调整糖度至18°Bx，pH自然，115 ℃灭菌15min。

1.3仪器与设备

SHP-160生化培养箱，上海三发科学仪器有限公司；GI54DWS高压灭菌器，致微(厦门)仪器有限公司；SW-CJ-2D双人单面洁净工作台，苏净安泰空气技术有限公司；NikonEclipseE100光学显微镜，南京贝登生物科技有限公司；UV-3100PC紫外分光光度计，上海美普达仪器有限公司；JA1203B电子天平，上海越平科学仪器有限公司；ZWY-2102C恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司。PX-B32T型水果糖度仪，广州市普析通仪器有限公司；Agilent7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司；SPME手动进样器、15mL进样瓶、57328-U手动固相微萃取装置、50/30μmDVB/CAR/PDMS固相微萃取纤维头，美国Supelco公司。

1.4产香酵母菌分离与纯化

称取5.00g酒曲粉碎样品加入到100mL无菌水制成悬液，取1.0mL加入到9.0mL麦氏培养基试管中，28 ℃，120r/min振荡富集培养24h。富集培养液梯度稀释，取10-2、10-3、10-4、10-5梯度稀释液各100μL，分别涂布于YPD平板，28 ℃培养48h。挑取酵母样菌落进行镜检，反复平板划线法纯化后接种于PDA斜面，28 ℃培养48h，4 ℃保藏备用。

1.5产香酵母筛选

将分离菌株划线接种于YPD平板上，28 ℃培养3～5d，通过嗅闻法[15]初步判断是否有酯香或醇香，筛选具有较浓酯香气或特殊果香气的菌株。将初筛获得的酵母菌接种于PDA液体培养基中，28 ℃活化培养24h至酵母菌数为108CFU/mL。将酵母菌活化液用按体积分数0.4%接入装有200mL豆芽汁液体培养基的250mL三角瓶中，28 ℃下静置培养3d。取150mL培养液转入250mL圆底烧瓶中，采用回流皂化法[16]测定培养液总酯含量(以乙酸乙酯计)，筛选出产酯量较高的菌株。

1.6产香酵母菌鉴定

1.6.1形态及生理生化鉴定

参照《酵母菌的特征与鉴定手册》[17]，进行菌株形态学观察和生理生化特征测定。

1.6.226SrRNAD1/D2区序列分析

采用酵母基因组提取试剂盒提取酵母总DNA。引物采用NL1：5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，NL4：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’。50μLPCR扩增反应体系：Taq酶0.25μL、Buffer5μL、dNTP4μL、DNA模板1μL、引物NL1/NL4各1μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5min，94 ℃变性1min，48 ℃退火1min，72 ℃延伸1min，30个循环。PCR产物用凝胶回收试剂盒纯化后，送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。测得序列与GenBank数据库进行BLAST比对，选取相似度较高的模式菌株序列，用ClustalX1.83软件进行序列比对，用MEGA5.1软件，Neighbor-Joining法构建系统发育树。

1.7产香酵母Z133生长耐受性能测定

制备不同初始糖度、不同pH、不同SO2质量分数及不同乙醇体积分数的灭菌西瓜汁培养基，按1×105CFU/mL接种量接入酵母菌种子液，28 ℃培养48h，血球计数法测定酵母细胞总数，以考察菌株对糖度、酸度、SO2及乙醇的耐受性。同时将相同接种量的西瓜汁培养基在不同温度下培养48h计数，考察菌株温度耐受性。

1.8产香酵母Z133发酵低醇西瓜果酒挥发性香气成分分析

1.8.1低醇西瓜果酒发酵及理化指标测定

将榨汁过滤的西瓜汁，用蔗糖调整糖度至20°Bx，柠檬酸调pH至4.0，添加80mg/LSO2，按1×105CFU/mL接种量接入酵母菌种子液，30 ℃发酵6d后过滤澄清，获得低醇西瓜果酒。发酵过程中总糖、总酸及乙醇体积分数测定参考GB/T15038—2006[18]。

1.8.2果酒挥发性香气成分分析

采用顶空固相微萃取-气质联用法[8, 15]。取5mL果酒(或西瓜汁)于15mL顶空瓶中60 ℃恒温水浴平衡5min，将老化好的固相微萃取头插入顶空瓶中萃取30min，移入GC-MS进样口解吸3min，分析香气成分。色谱条件：毛细管色谱柱AgilentHP-5MS(30m×250μm，0.25μm)；手动不分流进样，进样口温度250 ℃；程序升温：初始温度40 ℃，保留2min，以5 ℃/min到220 ℃，保留2min；检测器温度250 ℃；载气He，流速1mL/min。质谱条件：EI电离源，230 ℃，电子能量70eV，四极杆温度150 ℃，质量扫描范围50～550u。未知化合物经计算机检索同时与NIST11谱库匹配，对匹配度大于80的化合物进行分析，峰面积归一法计算香气成分的相对含量。

1.9数据统计分析

实验结果以平均值±标准差表示，用DPS7.05软件，Duncan’s新复极差法进行结果显著性差异分析。

2　结果与分析

2.1产香酵母筛选

从YPD平板上挑出具有酵母菌典型特征的菌落，结合显微形态观察从中温酒曲分离获得36株酵母菌株，中高温曲未分离到酵母菌。

将分离纯化的36株酵母菌划线于YPD平板上，28 ℃培养3～5d，通过嗅闻初步筛选出风味柔和、有发酵香气的5株菌Z133、Z2、Z31、Z32、Z43，其中Z133菌株具有特殊的果香味。将具有发酵香气的5株酵母菌接种到豆芽汁培养基中静止培养3d，测定培养液总酯含量。由表1可见，酵母菌株Z31培养液总酯含量最高，为0.48g/L，菌株Z133培养液总酯含量最低，但其发酵具有浓郁的果香香气，而其他4株酵母香气较淡。

表1　五株酵母菌培养液总酯含量

注：不同小写字母表示在P<0.05水平上差异显著。

2.2产香酵母鉴定

2.2.1形态学鉴定

5株产香酵母菌的菌落形态和细胞形态特征见表2和图1。

表2　五株产香酵母菌落特征

图1　五株产香酵母菌落特征Fig.1　Colony morphology of five aroma-producing yeast strains on PDA plates

2.2.2生理生化鉴定

表3是5株酵母生理生化特征结果，根据《酵母菌的特征与鉴定手册》初步将Z133鉴定为威克汉姆酵母属Wickerhamomyces，Z2、Z31、Z32和Z43鉴定为复膜孢酵母属Saccharomycopsis。

2.2.326SrRNA序列分析鉴定

将菌株26SrRNAD1/D2片段序列测序结果与GenBank数据库中酵母模式菌株基因序列进行BLAST比对，选取相似度较高的标准菌株序列，Neighbor-Joining法构建系统发育树。

由图2可见，菌株Z133与异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalusNRRLY-366(GenBank登录号：U74590)聚在同一分支，且支持率100%，Z2，Z31，Z32，Z43四株菌与扣囊复膜酵母Saccharomycopsis fibuligera(GenBank登录号：U40088)聚在同一分支。因此，结合形态学和生理生化特征，将Z133鉴定为异常威克汉姆酵母W. anomalus，Z2，Z31，Z32，Z43鉴定为扣囊复膜酵母S.fibuligera。

表3　5株产香酵母生理生化特性

注：“+”为阳性，“-”为阴性。

2.3产香酵母Z133发酵耐受性

果酒发酵酵母生长发酵的耐受性能是评价菌株发酵能力的重要方面，同时也是进行果酒发酵条件控制的主要依据。由表4可知，菌株Z133生长温度范围较宽，在30 ℃生长发酵最快。在15～25°Bx的糖度范围内生长良好，最低可耐受pH3.0的酸性环境。此外，该菌株对SO2和乙醇的耐受性良好，最高可耐受200mg/L的SO2浓度及体积分数12%的乙醇。

2.4产香酵母Z133发酵低醇西瓜果酒挥发性香气成分

本实验筛选获得5株产香酵母中，菌株Z133总酯产量虽然不高，但其培养液具有浓郁的果香气味。因此以菌株Z133为发酵菌株，按1.7.1方法发酵低醇西瓜果酒，获得的西瓜果酒酒体金黄色，清亮透明，光泽较好，有浓郁的酒香气和西瓜果香，酸甜适口，酒体较完整，饶有余味。由表5可见，Z133可消耗利用

西瓜汁中的糖分发酵转化成乙醇，6d后获得的低醇西瓜果酒乙醇体积分数为5.6%，酸度为4.7g/L。

图2　基于26S rRNA D1/D2区域序列构建的5株产香酵母菌系统发育树Fig.2　Phylogenetic tree of five aroma-producing yeast strains based on 26S rRNA D1/D2 domain sequence analyses

表4　产香酵母Z133发酵耐受性实验结果

注：“-”表示未生长发酵；同列数值后不同小写字母表示在P<0.05水平上差异显著，下表同。

表5　产香酵母Z133发酵西瓜果酒过程中还原糖、残糖、酸度和乙醇体积分数的变化

注：-表示未测定。

采用顶空固相微萃取结合气质联用法检测分析了西瓜汁与发酵西瓜果酒的挥发性香气成分。由表6可知，西瓜汁中挥发性香气成分较少，主要包括醛类、烯类、酸类成分，其中壬醛和柠檬醛为主要醛类物质，相对含量分别为5.10%和4.59%，烯类包括β-甜没药烯、α-姜黄烯和β-柏木烯，相对含量分别为3.14%、1.25%和2.17%，此外葵醚相对含量2.86%。

本实验检测到的挥发性化合物种类相对于其他研究结果[19-20]较少，这除了与所用西瓜材料品种及成熟度有关外，还与所用挥发性物质萃取分离分析的技术条件有关。相对于未发酵西瓜汁，Z133发酵6d获得的低醇西瓜果酒增加了4种醇类和4种酯类挥发性香气成分。其中乙醇、苯乙醇是主要醇类物质，相对含量分别为4.81%和25.65%，而酯类主要为乙酸异戊酯和乙酸香叶酯，相对含量分别达3.93%和6.41%。结果表明菌株Z133赋予西瓜果酒独特的感官风味与其发酵代谢西瓜汁过程中产生的醇类和酯类物质有关。

表6　产香酵母Z133发酵低醇西瓜果酒和西瓜汁挥发性成分比较

注：-表示未检测到。

3　讨论

本实验从白酒中温曲中分离到5株产香酵母，包括1株异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalus和4株扣囊复膜酵母Saccharomycopsis fibuligera，均是酱香型[21]和浓香型[12]酒曲中常见的优势非酿酒酵母。本实验发现异常威克汉姆酵母Z133豆芽汁培养液总酯含量虽然不高，但其发酵的西瓜果酒具有怡人的浓郁果香味，同时在生长耐受能力方面具有发酵低醇西瓜果酒的应用潜力。

低醇果酒是乙醇体积分数为1%～7%的发酵果酒[18]，可减少高酒精度对身体健康的危害，且口感柔和，受到越来越多的消费群体，特别是酒精耐受力较弱人群的青睐。同时乙醇浓度对果酒芳香风味有着重要影响，较高的乙醇含量降低一些香气成分的贡献率，导致果酒芳香度降低，风味更淡[22-23]。低醇果酒能以较低的乙醇含量改善目前果酒风味淡薄的问题，近年来逐渐成为果酒研究的重要趋势。而非酿酒酵母乙醇产量低的代谢特点正适合于发酵低醇果酒，是发酵低醇果酒的重要方式[24]。

本实验筛选获得的异常威克汉姆酵母Z133发酵6d即可获得乙醇体积分数5.6%的低醇西瓜果酒，同时代谢产生多种醇类、酯类香气化合物，赋予其独特的发酵醇香和酯香气。其中苯乙醇相对含量最高，为25.65%，在其他来源的异常威克汉姆酵母产香代谢物研究中均有报道[8, 25-27]。

本研究从白酒酒曲中分离筛选获得5株产香酵母菌株，经鉴定分属于异常威克汉姆酵母和扣囊复膜酵母。其中异常威克汉姆酵母Z133产果香能力强，能够耐受200mg/LSO2及体积分数12%的乙醇，以其发酵获得的低醇西瓜果酒乙醇体积分数5.6%，含有苯乙醇、乙酸异戊酯、乙酸香叶酯等香气成分。Z133具有发酵低醇西瓜果酒的潜力。

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Screeningandidentificationofaroma-producingyeaststrainsforlow-alcoholwatermelonwineandcharacterizationofaromaticcompounds

SHENGuang-hui*，LIMei，WANGYue，YANGHong-xia，TANGQian，LIUXiao-ying，ZHANGZhi-qing

(CollegeofFoodScience,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an625014,China)

Toobtainyeaststrainforlow-alcoholwatermelonwineproduction,fivearoma-producingyeaststrainswereisolatedfromtraditionalChinesewinestarterbyolfactometryandesterproductiondetermination.Basedonmorphological,physiologicalandbiochemicalcharacteristicsand26SrRNAD1/D2domainsequenceanalysis,strainZ133wasidentifiedasWickerhamomyces anomalusandZ2,Z31,Z32andZ43wereidentifiedasSaccharomycopsis fibuligera.StrainZ133couldproduceenjoyablefruitaromaflavorandshowedwelltolerancetosugar,SO2andethanol.Thearomacompoundsinlow-alcoholwatermelonwine(ethanolconcentrationwas5.6%)fermentedwithstrainZ133wereanalyzedbyheadspacesolidphasemicroextractioncombinedwithgaschromatography-massspectrometry,andthemainvolatilearomacompoundsinlow-alcoholwatermelonwinewerebenzeneethanol,geranylacetateandisoamylacetate,whichrepresented25.65%, 6.41%and3.93%ofthetotalvolatilecompounds,respectively.TheresultsshowedthatstrainZ133hadgreatpotentialforproducinglow-alcoholwatermelonwine.

ester-producingyeast;low-alcoholwatermelonwine;aromaticcompounds;headspacesolidphasemicroextraction

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608019

博士，讲师(本文通讯作者，E-mail:shenghuishen@163.com)。

国家公益性行业(农业)科研专项(201303073)；四川农业大学大学生科研兴趣培养计划项目(2014155)

2016-02-24，改回日期：2016-04-07