植物甾醇酯的酶法合成*

么婷婷，辛嘉英,2*，王艳，郑洛昀，王政洋

（1.哈尔滨商业大学食品科学与工程重点实验室，黑龙江哈尔滨150076；2.中国科学院兰州化学物理研究所羰基合成与选择氧化国家重点实验室，甘肃兰州730000）

植物甾醇酯的酶法合成*

么婷婷1，辛嘉英1,2*，王艳1，郑洛昀1，王政洋1

（1.哈尔滨商业大学食品科学与工程重点实验室，黑龙江哈尔滨150076；2.中国科学院兰州化学物理研究所羰基合成与选择氧化国家重点实验室，甘肃兰州730000）

以油酸和植物甾醇为反应底物，利用脂肪酶催化合成植物甾醇油酸酯。对脂肪酶和反应介质进行了筛选，同时对影响合成植物甾醇油酸酯反应的因素进行了探究，考察了底物摩尔比（油酸甾醇比）、酶添加量（脂肪酶质量/底物总质量）、反应温度及反应时间对酯化反应的影响。在单因素的基础上，经酯化率响应曲面实验优化反应条件，确定最佳反应条件：催化酯化反应的酶为柱状假丝酵母脂肪酶（CRL，Candida rugosa lipase），反应介质为正己烷，底物摩尔比为3∶1，酶添加量为7.2%，反应温度为45.3℃，反应时间为25.3h，验证试验酯化率可达72.95%。

脂肪酶；植物甾醇油酸酯；响应曲面分析

植物甾醇在植物中存在范围非常广泛，是一类以环戊烷全氢菲（甾核）为骨架的天然醇类化合物，具备许多有实际应用意义的生理功能［1,2］。植物甾醇结构与胆固醇相似，在生物体内与胆固醇以同样的方式被吸收，植物甾醇能阻碍胆固醇吸收，使其在肠道中的吸收相应下降，从而具有降低血中胆固醇量作用［3,4］。植物甾醇具有类激素、类生长素的功能；有增强免疫力、抗炎、抗衰老、预防糖尿病的功能；可使肌肉增生，促进伤口愈合，增强毛细血管内的循环；而且对预防心血管疾病有一定的作用［5,6］。植物甾醇广泛地应用于医药、化妆品和食品等行业［7］。但植物甾醇不溶于水，脂溶性也相当有限的缺点限制了其应用前景。酯化后的植物甾醇酯不仅大大改善了植物甾醇的脂溶性，而且抑制人体对胆固醇的吸收作用优于植物甾醇,降胆固醇效果更好［8］。植物甾醇酯的合成主要有化学法和酶法［9］。酶法更绿色环保、高效，且反应条件温和。酶法合成植物甾醇酯也是国内外研究的热点［10-13］。

本文以脂肪酶作为催化剂，探究催化植物甾醇与油酸合成植物甾醇油酸酯的酯化反应，在单因素的基础上，应用响应曲面法对酯化反应进行优化研究。

1　实验部分

1.1材料与试剂

油酸（AR天津市永大化学试剂有限公司）；植物甾醇（浙江大为药业有限公司）；柱状假丝酵母脂肪酶（lipase from Candida rugosa，CRL，Type VII，847U·mg-1，Sigma公司）；固定化南极假丝酵母脂肪酶（immobilized Candida antarctica lipase，Novozym435，Type II，10,000U·g-1丹麦诺维信生物技术有限公司）；木瓜脂肪酶粗酶（lipase from Carica papaya，CPL广西南宁天绿生物制品有限公司）；猪胰脂肪酶（lipase from porcine pancreatic，PPL，Type II），30～90U·mg-1Sigma公司）。薄层层析硅胶（青岛海洋化工厂）；羧甲基纤维素钠（天津市嘉兴化工有限公司）；正己烷，无水乙醚，冰乙酸，环己烷，异辛烷，苯均为分析纯，天津市永大化学试剂有限公司；Type4Å型分子筛（大连催化剂厂）。

1.2主要仪器

KH-2000型薄层色谱扫描仪（上海科贺生化科技有限公司）；HZQ-C空气浴振荡器（哈尔滨东明医疗器械厂）；BS210S电子天平（德国Sartorius仪器公司）；DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱（上海-恒科学仪器有限公司）。

1.3实验方法

1.3.1植物甾醇油酸酯的合成方法精确称取一定摩尔比的油酸和植物甾醇以及一定量的脂肪酶，加入到50mL的具塞三角瓶中，同时加入一定量有机溶剂，1～2粒4Å分子筛除水，一定的温度和时间下，在150r·min-1空气浴振荡器（摇床）中进行反应。

1.3.2植物甾醇油酸酯的酯化率的测定将硅胶GF254用3.5倍质量的1%的羧甲基纤维素钠水溶液调成均匀的糊状，然后倒于60mm×120mm的层析板上，制成厚度约2mm的均匀的薄板，自然晾干后于110℃干燥箱中活化2h，用10μL的微量进样器取4μL酯化反应液点于薄板的底端，用选好的展开剂：正己烷：乙醚：冰乙酸（90∶10∶1，V/V/V）于室温下层析缸中展开30min，自然晾干，然后用薄层色谱扫描仪进行检测和数据的计算，根据其峰面积计算出植物甾醇油酸酯的酯化率（%），计算公式如下：

2　结果与讨论

2.1脂肪酶的筛选

底物油酸与植物甾醇的摩尔比3∶1，酶加量为底物总质量的7%，正己烷5mL，反应温度45℃，150r·min-1摇床反应24h条件下，分别对CRL、N435、CPL和PPL催化油酸与植物甾醇酯化反应的活性进行了比较，见图1。

图1　脂肪酶对酯化反应的影响Fig.1 Effect of lipase on esterification

不同种类不同来源的脂肪酶对催化底物的特异性也有所不同，由图1可知，在相同的反应条件下，脂肪酶CRL催化合成植物甾醇油酸酯的酯化率最高。可能是因为脂肪酶CRL对底物的特异性选择更强，从而催化酯化反应效果好，因此，选取脂肪酶CRL作为催化植物甾醇油酸酯合成的酶催化剂。

1.2反应体系的筛选

由于反应体系不容易混合均匀，所以必须加入适当的溶剂来增大反应物与酶之间的接触面积，从而提高反应效率。

选取异辛烷、正己烷、环己烷、苯4种极性分别为0.1、0.06、0.1、3的有机溶剂作为反应介质，底物油酸与植物甾醇的摩尔比3∶1，酶加量为底物总质量的7%，反应温度45℃，150r·min-1摇床反应24h条件下，分别讨论不同log P值的有机溶剂对酯化反应的影响。

表1　有机溶剂对酯化反应的影响Tab.1 Effect of organic solvents on esterification

由表1可知，以正己烷作为反应介质时，甾醇酯的酯化率比较高，以环己烷、异辛烷作为反应介质时，甾醇酯的酯化率比较低，以苯为反应介质时，不反应。极性小的有机溶剂酯化率高，说明这时酶的催化活性好。这是因为有机溶剂极性越大，对应的log P值越小，有机溶剂的亲水性就越强，而脂肪酶表面有一层水化层，是酶活性中心的必需水［14］，有机溶剂亲水性越强越易与酶表面的水结合从而夺去酶表面的必需水，导致酶的催化活性受到抑制而降低甚至失活，从而使酯化反应的酯化率降低甚至不反应。因此，选取极性较低，对酶活性影响较小的正己烷作为酯化反应的介质。

2.3影响酯化反应的因素

2.3.1底物摩尔比对酯化反应的影响反应底物摩尔比对酯化反应酯化率的变化影响较大，由于酯化反应是可逆反应，因此可提高某一底物的含量使反应平衡向生成物方向进行，以提高酯化率。由于油酸价格便宜且容易去除，因此选择底物油酸过量。在酶添加量为底物总质量的7%，正己烷5mL，反应温度45℃，150r·min-1摇床反应24h的条件下，研究反应底物摩尔比对甾醇酯的合成的影响，见图2。

图2　底物摩尔比对酯化反应的影响Fig.2 Effect of substratemolar ratio on esterification

由图2可知，底物摩尔比在1∶1至3∶1变化时，酯化率逐渐上升，在3∶1时达到最高。这是因为随着底物油酸量的增加，反应平衡向着生成物的方向移动，使得酯化率升高。但继续增加油酸的量，酯化率反而降低，这表示油酸过度的添加不利于甾醇酯的生成。这是因为当底物摩尔比达到3∶1时，体系中的酶已经完全饱和，继续增加油酸的量会导致甾醇的相对浓度降低，不利于酯化反应的进行，因此油酸与植物甾醇的最优摩尔比为3∶1，并用于以后的反应。

2.3.2酶添加量对酯化反应的影响酶作为一种生物催化剂，在一定的浓度范围内对酯化反应的酯化率有显著影响。在底物摩尔比为3∶1，正己烷5mL，反应温度45℃，150r·min-1摇床反应24h的条件下，研究酶添加量对植物甾醇油酸酯的合成的影响，见图3。

图3　酶添加量对酯化反应的影响Fig.3 Effect of enzyme addition amount on esterification

由图3可知，酶添加量从2%到8%变化时，随着酶用量的增加，酯化率成上升趋势，在8%时达到最高。这是因为酶作为一种催化剂，催化了反应向着生成物的方向进行，使得酯化率升高。但随着酶的量继续添加，酯化率反而略有下降。这是可能是因为酶用量过大，造成酶聚集在一起使其与底物接触面积相对减小，导致酯化率降低。因此，选取酶添加量为底物总质量的8%为最优，并用于以后的反应。

2.3.3反应温度对酯化反应的影响酶作为生物催化剂，有其适宜的催化温度范围，因此温度也是影响酶催化反应的重要因素之一。在底物摩尔比为3∶1，酶用量为底物总质量的8%，正己烷5mL，150r·min-1摇床反应24h的条件下，研究反应温度对植物甾醇油酸酯的合成的影响，见图4。

图4　反应温度对酯化反应的影响Fig.4 Effectof reaction temperature on esterification

由图4可知，当温度从30℃至45℃变化时，酯化率呈上升趋势，在45℃时达到最高。这是因为升高温度可以使反应底物的黏度降低，提高底物的溶解度，减小传质阻力，从而有利于酶与反应底物间的相互作用，使得酯化率升高。但当温度超过45℃时，酯化率下降。可能是因为酶作为生物催化剂，有其适宜的催化温度范围，温度过高则会导致酶结构发生变化而失去催化活性。因此，45℃为最佳温度，并用于以后的反应。

图5　反应时间对酯化反应的影响Fig.5 Effectof reaction time on esterification

2.3.4反应时间对酯化反应的影响确定最佳的反应时间可以避免实验时间浪费，从而提高工作效率。在底物摩尔比为3∶1，酶用量为底物总质量的8%，正己烷5mL，反应温度45℃，150r·min-1摇床反应的条件下，研究反应时间对植物甾醇油酸酯的合成的影响，见图5。由图5可知，反应时间从6h到24h变化时，酯化率呈上升趋势，在24h时达到最高。但24h后，随着反应时间的延长，酯化率呈下降趋势。这是因为酯化反应是一个可逆反应，随着反应的进行，产生的水会导致反应向反方向进行，使植物甾醇油酸酯逐渐分解为甾醇和油酸，从而使酯化率开始下降。因此，24h为最佳时间。

2.4Candida rugosa脂肪酶催化植物甾醇油酸酯合成的优化实验

2.4.1响应曲面因素水平的设定在单因素的基础上，采用响应面试验方法对影响酯化率的因素进行分析及参数优化，各因素及水平见表2。

表2　响应曲面因素水平表Tab.2 Factors and levels of RSM

2.4.2响应曲面实验方案及结果选择反应时间（A）、反应温度（B）、底物摩尔比（C）、酶添加量（D）4个因素，每个因素设定3个水平，以酯化率（Y）为指标，采用Design-Expert.8.05中心组合试验Box-Behnken设计实验。响应面试验方案及结果见表3。

表3　植物甾醇油酸酯酶法合成响应面试验方案及结果Tab.3 Design and results of RSM

2.4.3二次回归模型的方差分析

试验结果采用Design-Expert8.05软件的ANOVA程序进行二次回归分析，模型P＜0.0001＜0.01，表明本实验所选用的二次模型是极其显著的。失拟性检验P=0.2555，不显著，且R2为0.9981，因此该模型拟合程度良好，试验误差小。因此证明该回归模型优化反应时间、反应温度、底物摩尔比和酶添加量对酯化反应的酯化率的影响是可行的。

根据方程各项方差分析表明，回归方程的一次项A、B、C、D对酯化率的影响显著（P＜0.05）；二次项A2、B2、C2、D2对酯化率影响极显著（P＜0.01）；交互项AC、AD、BC对酯化率影响极显著（P＜0.01）。

反应时间（A）、反应温度（B）、底物摩尔比（C）、酶添加量（D）与酯化率（Y）的二元回归方程为：

表4　回归模型的方差分析Tab.4 ANOVA analysis of the quadratic regressionmodel

2.4.4响应曲面分析将对酯化反应有显著影响的交互作用AC、AD、BC绘制出相应的三维响应曲面图，见图6～8：

图6底物摩尔比和反应时间等高线及响应曲面Fig.6 Contour and response surface of substrate molar ratio and reaction time

图6显示在因素B（反应温度）、D（酶添加量）为最优条件时，因素A（反应时间）、C（底物摩尔比）对酯化率的交互影响。由图6-b可看出，当A（反应时间）保持不变时，随着C（底物摩尔比）的增加，酯化率逐渐增加，然而当到达峰值后酯化率随之减小；C（底物摩尔比）保持不变时，随着A（反应时间）增加，酯化率逐渐增加，达到峰值后逐渐减小。

图7酶添加量和反应时间等高线及响应曲面Fig.7 Contour and response surface of enzyme addition amount and reaction time

图7显示在因素B（反应温度）、C（底物摩尔比）为最优条件时，因素A（反应时间）、D（酶添加量）对酯化率的交互影响。由图7-b可看出，当A（反应时间）保持不变时，随着D（酶添加量）的增加，酯化率随酶添加量的增加而增大且增加趋势越来越缓慢；D（酶添加量）保持不变时，随着A（反应时间）增加，酯化率逐渐增加，达到峰值后逐渐减小。

图8底物摩尔比和反应温度等高线及响应曲面Fig.8 Contour and response surface of substrate molar ratio and reaction temperature

图8显示在因素A（反应时间）、D（酶添加量）为最优条件时，因素B（反应温度）、C（底物摩尔比）对酯化率的交互影响。由图8-b可看出，当B（反应温度）保持不变时，随着C（底物摩尔比）的增加，酯化率逐渐增加，然而当到达峰值后响应值随之减小；C（底物摩尔比）保持不变，随着B（反应温度）增加，酯化率逐渐增加，达到峰值后酯化率逐渐减小。

通过Design-Expert8.05软件对回归方程进行分析，得到酯化率的最佳条件为反应时间25.31h，反应温度45.30℃，底物摩尔比3.03∶1，酶添加量7.22%，此时酯化率理论最大值为73.49%。

采用上述优化后的条件，即反应时间25.3h，反应温度45.3℃，底物摩尔比3∶1，酶添加量7.2%，进行3次平行验证实验，得到的酯化率平均值为72.95%，说明试验具有良好的重复性。因此，采用此响应面法优化酯化反应因素比较准确可靠，具有实际应用价值。

3　结论

本文研究了不同脂肪酶对植物甾醇油酸酯合成的催化效果，筛选了适合酯化反应的反应介质，考察了影响酯化反应的因素，在单因素试验基础上，通过响应面试验分析，得到合成植物甾醇油酸酯的最优反应参数：以脂肪酶CRL作为催化剂，以正己烷作为反应介质，底物摩尔比为3∶1，酶添加量为7.2%，反应温度为45.3℃，反应时间为25.3h，最优条件为下酯化率可达72.95%。

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Synthesis of phytosterol esters catalyzed by lipase*

YAO Ting-ting1，XIN Jia-ying1，2*，WANG Yan1，ZHENG Luo-yun1，WANG Zheng-yang1
（1.Key Laboratory for Food Science and Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China；2.State Key Laboratory for Oxo Synthesis and Selective Oxidation，Lanzhou Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Lanzhou 730000，China）

With oleic acid and plant cholesterol as substrate，phytosterol oleic acid esterswas synthesized by lipase-catalyzed esterification.The lipase and reactionmedium were screened，and the effects of substratemolar ratio（molar ratio of oleic acid to phytosterols），enzyme addition amount，reaction temperature，reaction time on esterification were studied.Based on single factor experiment，reaction conditionswere optimized by response surface experiment，a quadratic regression equation of esterification was established.The optimal synthesis conditions were as follows：esterification was catalyzed by Candida rugosa lipase，n-hexane as reactionmedium，substratemolar ratio of 3∶1，enzyme addition amount of 7.2%，reaction temperature of 45.3℃and reaction time of 25.3h.Under the optimal conditions，the esterification conversion could reach up to 72.95%.

lipase；phytosterol oleic acid esters；response surfacemethodology（RSM）

O643.32

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20160904

2016-07-06

黑龙江省应用技术研究与开发项目（No.GC13C111）

么婷婷（1990-），女，在读硕士研究生，研究方向：农产品加工及贮藏工程专业。

导师简介：辛嘉英（1966-），男，博士，龙江学者特聘教授，博士生导师。