干细胞移植治疗噪声性和药物性聋的比较实验研究△

朱汉卿　张军峰　徐侦



·实验研究·

干细胞移植治疗噪声性和药物性聋的比较实验研究△

朱汉卿1张军峰2徐侦3

目的比较耳蜗干细胞移植治疗噪声性聋豚鼠和药物性聋豚鼠模型的效果。方法选用清洁级健康成年纯白红目豚鼠120只，建立噪声性聋模型耳蜗干细胞移植组、噪声性聋模型空白对照组、药物性聋模型耳蜗干细胞移植组、药物性聋模型空白对照组，每组30只；向噪声性聋模型耳蜗干细胞移植组和药物性聋模型耳蜗干细胞移植组耳蜗分别注入耳蜗干细胞悬液10 μl，向噪声性聋模型空白对照组和药物性聋模型空白对照组耳蜗分别注入10 μl生理盐水。于术后7、28、56 d进行ABR检测并进行免疫荧光观测Nestin阳性细胞数和MyosinⅦA阳性细胞数。结果在噪声性聋和药物性聋耳蜗干细胞移植组的耳蜗鼓阶处观测到Nestin阳性细胞和MyosinⅦA阳性细胞，但噪声性聋干细胞移植组的Nestin阳性细胞和MyosinⅦA阳性细胞数量多于药物性聋干细胞移植组；耳蜗干细胞移植后噪声性聋和药物性聋组ABR反应阈均下降，但术后28天和56天噪声性聋干细胞移植组ABR阈值分别为52.61±5.14和40.39±4.59 dB SPL，低于药物性聋干细胞移植组(分别为66.39±4.77和60.41±4.17 dB SPL)。结论耳蜗干细胞移植对于噪声性聋豚鼠模型的治疗效果优于药物性聋豚鼠模型。

耳蜗干细胞；移植；噪声性聋；药物性聋

Medicine,Nanjing， 210029, China)

感音性聋主要由多种因素引起的耳蜗毛细胞倒伏、萎缩和死亡导致[1]。由于人类耳蜗毛细胞的再生能力很弱，所以毛细胞的损伤不可逆，从而导致感音性聋的治疗一直是一个难题[2]。近年来，随着干细胞移植分化研究的深入，感音性聋的治疗研究取得了重大进展，即利用耳蜗干细胞移植分化为有功能性的毛细胞来治疗此类疾病[3～5]。导致感音性聋最常见的病因主要有噪声性和中毒性两类，选用何种原因导致感音性聋的动物模型观察耳蜗干细胞移植治疗感音性聋效果最佳，值得探讨；本研究尝试以耳蜗干细胞移植治疗噪声性聋和药物性聋豚鼠模型，比较二者的疗效，为后续药物干预研究提供方向[6，7]，报告如下。

1　资料与方法

1.1实验动物及分组选用耳廓反射灵敏、双耳ABR反应阈正常(4 kHz双耳ABR反应阈20～35 dB SPL)的健康成年纯白红目豚鼠(清洁级，由南京中医药大学动物室提供)120只，雌雄不分，体重220±30 g，均排除了中耳炎；将其分为噪声性聋模型耳蜗干细胞移植组(第一组)，噪声性聋模型空白对照组(第二组)和药物性聋模型耳蜗干细胞移植组(第三组)，药物性聋模型空白对照组(第四组)，每组30只。

1.2噪声性聋模型的建立60只豚鼠(第一、二组)于清醒正常状态下放入笼内固定于消声室自由声场中，脉冲噪声声源(压力峰值为180.0 dB SPL，脉宽0.25 ms，间隔时间20秒)距离豚鼠双耳15 cm，连续暴露300 次。噪声暴露后1 周进行ABR 测试，选择4、8、16、20 kHz各频率双耳ABR 阈值均≥60 dB SPL的豚鼠为备选动物。

1.3药物性聋模型的建立60只豚鼠(第三、四组)每日肌肉注射庆大霉素100 mg/kg,连续10 d，10 d后进行ABR测试，选择4、8、16、20 kHz各频率双耳ABR阈值均≥60 dB SPL的豚鼠为备选动物。

1.4耳蜗干细胞培养取新生(P0)豚鼠10只，用10%水合氯醛2 ml腹腔注射麻醉后，取出耳蜗，去除表面结缔组织及血管，分离出Corti器，用HBSS液多次冲洗后将其尽量剪碎，以0.125%胰蛋白酶37 ℃消化25分钟后200目铜网过滤，将滤液1 000 rpm离心4分钟，吸管轻柔吹打成单细胞悬液，按1×105个/毫升的密度装入培养瓶，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中，每3天半量置换培养基，根据细胞浓度，7天左右传代，以Nestin进行免疫荧光染色鉴定和Brdu标记细胞核[8]。

1.5耳蜗干细胞移植各组豚鼠麻醉后，在左耳后分层切开，暴露听泡并在镜下打开，在耳蜗底周鼓阶外侧壁下方，电钻一0.2 mm的小孔。第一、三组于造孔处用10 μl微量注射器在10 min时长内注入10 μl耳蜗干细胞悬液；第二、四组注入10 μl生理盐水。注射完毕留针2 min，然后以结缔组织和生物胶封堵钻孔处，逐层缝合切口。为预防中耳感染，术后肌肉注射头孢唑啉500 mg·kg-1·d-1，连续7 d[9]。

1.6听性脑干反应(ABR)测试各组分别于内耳注射后7、28和56 d进行ABR测试。10%水合氯醛腹腔注射麻醉豚鼠后固定，记录电极置于颅顶，参考电极置于左耳乳突，接地电极置于右耳乳突，以0.10 ms短音刺激，测试频率为20 kHz，刺激频率10次/秒，带通虑波80～3 000 Hz，扫描时程10 ms，叠加1 024次。声刺激从90 dB SPL起始，5 dB步距递减，记录ABR阈值[10]。

1.7耳蜗取材及荧光染色四组豚鼠于内耳注射后7、28和56 d分别随机抽取5只，以过度麻醉处死，在显微镜下取出听泡，于4 ℃下4%多聚甲醛固定24 h，EDTA脱钙3 d后置于30%的蔗糖内浸泡12 h，用OCT胶包埋后快速冰冻切片，片厚10 μm，PBS漂洗，避光操作。于各时间点用MyosinⅦA免疫荧光染色检测分化的毛细胞，用荧光显微镜观测并用分格计数法(分100格，每格实际长度0.01 mm)进行镜下视野毛细胞均值计数。

1.8统计学方法所有数据均采用SPSS13.0统计软件进行方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1噪声及药物性感音性聋豚鼠造模完成噪声暴露及庆大霉素注射后，第一～四组豚鼠都不同程度地出现烦躁、体重下降、听力下降，一周后ABR反应阈均大于80 dB SPL，镜下观察发现内耳毛细胞出现倒伏、萎缩，部分死亡(图1)，建模成功[11，12]。

2.2耳蜗干细胞的培养和鉴定P0豚鼠耳蜗干细胞在培养皿中生长良好，单细胞呈圆球形,3～4天后逐渐汇集成团(图2)，Nestin荧光染色检测呈阳性(图3)，用Brdu标记细胞核(图4)证明培养的是干细胞，此干细胞具有良好的增殖特性。

2.3ABR反应阈四组豚鼠于移植前1 d、移植后7、28和56 d左耳ABR反应见表1。

图1　感音性聋豚鼠模型内耳毛细胞(荧光显微镜×100)

可见，术后28和56 d第一、三组ABR阈值较各自空白对照组显著降低，说明耳蜗注入耳蜗干细胞后豚鼠听功能明显好转(P<0.05)；第一组术后28和56 d听功能恢复要明显优于第三组(P<0.05)。

2.4免疫荧光检测结果荧光显微镜观察到第一组和第三组豚鼠鼓阶内Nestin阳性细胞随时间延续逐渐减少(图5)，其中，第一组干细胞存活数量较第三组多(P<0.05)(表2)；术后28和56 d两组豚鼠鼓阶内均可见MyosinⅦA阳性的分化毛细胞(图6)，其中，第一组毛细胞分化数量较第三组明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表1　四组豚鼠干细胞移植前后左耳ABR反应阈值(dB ±s)

注：*与第二组比较，P<0.05；#与第四组比较，P<0.05；△与第三组比较，P<0.05

表2　第一、三组术后不同时间移植干细胞存活数和毛细胞分化数(个，±s)

注：*与第三组比较，P<0.05

图4　Brdu标记阳性细胞 (荧光显微镜×200)

3　讨论

本课题组在前期研究中发现干细胞移植可以有效改善感音性耳聋患者的听力，但是又出现了移植干细胞存活率和移植后的干细胞分化为毛细胞比例不稳定的问题[13]，因此，有必要在干细胞移植治疗感音性聋时进行实验模型的细分选择，找出适合干细胞移植治疗的最佳模型，以便进一步研究[14]。

本实验通过耳蜗干细胞移植术后7、28、56 d的ABR阈值检测发现，相对于空白对照组，无论是噪声性聋干细胞移植组，还是药物性聋干细胞移植组，其ABR阈值都有明显的恢复，同时在术后28 d和56 d的免疫荧光检测中观测到其鼓阶内存在大量的分化毛细胞，再次证明了耳蜗干细胞移植治疗噪声性聋和药物性聋都是有效的。术后7 d噪声性聋和药物性聋干细胞移植组ABR反应阈相对于空白对照组虽有下降，但差异无统计学意义，可能与术后7 d干细胞移植完成不久，分化为毛细胞的数量较少有关，这也从术后7 d荧光显微镜下观测到大量的Nestin阳性细胞而几乎不见MyosinⅦA阳性细胞得以证实，由此可以推断移植干细胞分化为毛细胞需要一段时间，该过程至少在7 d以上，即干细胞移植治疗感音性聋的见效时间不少于7 d。

文中结果显示耳蜗干细胞移植术后28 d和56 d噪声性聋和药物性聋干细胞移植组的ABR阈值持续下降，荧光显微镜下可见分化的毛细胞数量也在持续增加，但移植后7～28 d ABR阈值下降速度优于28～56 d，同时，免疫荧光观测中也发现术后7天几乎未见鼓阶内有分化的毛细胞，而到第28 d分化的毛细胞增加数要远多于术后28～56 d，说明两种耳聋模型的听力恢复都是一个长期的过程，但干细胞移植后近期的毛细胞分化数量对于感音性聋的恢复具有重大影响，至于术后28 d是否是毛细胞分化速率的峰值点，则需要更加充分的实验证明，这将在今后的实验中进一步研究。

从文中结果看耳蜗干细胞移植术后28 d和56 d噪声性聋干细胞移植组的ABR阈值均明显低于药物性聋干细胞移植组，同时，免疫荧光检测也可以看到噪声性聋干细胞移植组鼓阶移植的干细胞存活数量要多于药物性聋干细胞移植组，而噪声性聋干细胞移植组在7～28 d和28～56 d的移植干细胞死亡速率(即干细胞减少速率)都要慢于药物性聋干细胞移植组，同样，分化的毛细胞数量也大大多于药物性聋干细胞移植组。由此可见，相对于药物性聋，干细胞移植治疗噪声性聋的干细胞成活率和毛细胞分化率都更稳定，听力恢复效果更良好；因此，建议干细胞移植治疗感音性聋研究中，应该首选噪声性聋动物模型；本研究为进一步研究干细胞移植治疗感音性聋，提高移植干细胞存活率和移植后的干细胞分化为毛细胞的比例打下了一定的基础，也为本课题组后续的药物干预实验研究提供了方向。

1Tao L, Segil N. Early transcriptional response to aminoglycoside antibiotic suggests alternate pathways leading to apoptosis in sensory hair cells in the mouse inner ear[J]. Front Cell Neurosci,2015,21:190.

2Kuo BR, Baldwin EM, Layman WS, et al. In Vivo Cochlear Hair Cell Generation and Survival by Coactivation of β-Catenin and Atoh1[J]. J Neurosci,2015,35:10786.

3Zhang W, Zhang F, Han Y, et al. Auditory stimulation modulates CXCL12/CXCR4 expression in postnatal development of the newborn rat cochlea[J]. Neuroreport,2015,26:681.

4Costa A, Sanchez-Guardado L, Juniat S, et al. Generation of sensory hair cells by genetic programming with a combination of transcription factors[J]. Development,2015,142:1948.

5Ohnishi H, Skerleva D, Kitajiri S, et al. Limited hair cell induction from human induced pluripotent stem cells using a simple stepwise method[J]. Neurosci Lett,2015,599:49.

6刘翔. 感音神经性聋21例临床分析[J]. 中国卫生标准管理,2015,6:101.

7池青. 神经性耳聋耳鸣治疗方法探索[J]. 临床合理用药杂志,2013,6:117.

8邰浩清.内耳干细胞培养、移植实验研究[J].徐州医学院学报,2008,28:431.

9郑鸿燕，邰浩清，曾水林.当归补血汤对感音神经性聋大鼠耳蜗干细胞移植后细胞凋亡的影响[J]. 听力学及言语疾病杂志,2010,18:271.

10梁媛,张淑君.5-磷酸二醋酶抑制剂对噪声性聋影响的实验研究[J].中华耳科学杂志,2016,14:99.

11卢振东，杨军．听觉剥夺和耳蜗内电刺激引起幼鼠听觉通路bndf和c-fos基因及蛋白改变[J]．山东大学耳鼻喉眼学报，2012,26:17.

12王永华,王枫,李文靖.金匮肾气丸对庆大霉素致聋豚鼠神经生长因子表达的实验研究[J].浙江中医杂志,2014,49:169.

13郑鸿燕，邰浩清，曾水林.当归补血汤对耳蜗干细胞鼓阶内移植治疗药物性感音神经性耳顾大鼠增效作用研究[J]. 东南大学学报(医学版)，2010,29：176.

14Jang S, Cho HH, Kim SH, et al.Neural-induced human mesenchymal stem cells promote cochlear cell regeneration in deaf Guinea pigs[J]. Clin Exp Otorhinolaryngol,2015,8:83.

(2016-01-01收稿)

(本文编辑雷培香)

A Comparative and Experimental Study on the Treatment of Noise Induced Hearing Loss and Toxic Hearing Loss with the Stem Cells Transplantation

Zhu Hanqing*, Zhang Junfeng, Xu Zhen

(*Department of Anatomy and Histology,Nanjing University of Chinese

ObjectiveTo compare the effect of the cochlear stem cells transplantation in treating the noise induced hearing loss model and toxic hearing loss model.MethodsThe Experimental guinea pigs were divided into three groups: the group of the noise induced hearing loss model treated with the cochlear stem cells, the blank control group of toxic hearing loss model treated with the cochlear stem cells and noise induced hearing loss model and the blank control group of toxic hearing loss model. The cochlear stem cells suspension and physiological saline were transplanted into the cochlear inner ears of the three groups, respectively. ABR detection and immunofluorescence observation were implemented three times in 7 days, 28days and 56 days after the operation, respectively.ResultsNestin positive cells and Myosin ⅦA positive cells were detected in both of the two models treated with cochlear stem cells, but the number of Nestin positive cells and Myosin ⅦA positive cells detected in noise induced hearing loss model was higher than that in the toxic hearing loss model. The ABR responses decreased on the noise induced hearing loss model and toxic hearing loss model treated with cochlear stem cells transplantation, but the hearing recovery of guinea pigs in the noise induced hearing loss model was superior to the toxic hearing loss model at 28 days and 56 days after operation.ConclusionThe cochlear stem cells transplantation is more effective in treating noise induced hearing loss than toxic hearing loss model.

Cochlear stem cells;Transplantation;Noise induced hearing loss;Toxic hearing loss

△江苏省高校自然科学基金项目( 12KJD360002)、江苏省高校优势学科建设工程(PAPD)联合资助

1南京中医药大学解剖与组胚教研室(南京210029)；2南京中医药大学微生物与免疫学教研室；3南京医科大学第二附属医院

朱汉卿，男，江苏人，讲师，主要研究方向为神经干细胞。

10.3969/j.issn.1006-7299.2016.05.014

R764.43+3

A

1006-7299(2016)05-0478-04

网络出版时间：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20160830.1108.004.html

网络出版地址：2016-8-3011:08