质膜钙ATP酶异构体1～4的剪接体在新生大鼠前庭器官的表达△

罗蜜　褚汉启　陶雁玲　周良强　陈金　刘云　潘春晨　陈请国



·实验研究·

质膜钙ATP酶异构体1～4的剪接体在新生大鼠前庭器官的表达△

罗蜜1,2褚汉启1陶雁玲1周良强1陈金1刘云1潘春晨1陈请国1

目的研究质膜钙ATP酶异构体(plasma membrane Ca2+-ATPase isoforms，PMCAs)1～4(PMCA1～4)的A端和C端剪接变异体在新生大鼠前庭器官的表达。方法取出生2天的健康SD大鼠10只, 断头后分离出前庭器官(椭圆囊斑和球囊斑)，提取总RNA，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法，检测PMCA1～4的A端和C端剪接变异体的表达。结果在新生大鼠的椭圆囊斑和球囊斑PMCA1～4表达的剪接体分别为PMCA1x/b, PMCA2w/(a、b)，PMCA3z/(a、b、c)和PMCA4 (x、z)/b。结论在新生大鼠前庭器官，PMCA1、PMCA2、PMCA3和PMCA4之间表达的A端和C端剪接变异体类型均不同, 这可能是由于椭圆囊斑和球囊斑对这些PMCA亚型有着不同的Ca2+调节需求。

质膜钙ATP酶异构体1～4；剪接体；椭圆囊斑；球囊斑

在内耳，精准地控制毛细胞内Ca2+浓度对维持正常的听觉和平衡觉十分关键。质膜钙ATP酶异构体(plasma membrane Ca2+-ATPase isoforms，PMCAs)是维持细胞内Ca2+浓度平衡的重要蛋白质之一，其主要作用是将细胞内Ca2+转移到细胞外，从而维持细胞内低Ca2+水平，保证其发挥正常的生理功能。PMCAs存在4种亚型，分别是 PMCA1～4，由ATP2B1～4基因编码，其结构上存在两个位点，分别是PMCAs胞质区的第一个结构环(A端)和PMCAs胞质尾端的C末端(C端)[1]。PMCA1～4结构序列的 A 端和C 端存在着不同形式的剪接体[2]，这些剪接体可以通过调节调控元件来影响PMCA1～4的排钙能力[3]。已证实PMCA2突变的小鼠出现平衡功能障碍，主要是由于前庭毛细胞内的Ca2+不能有效地进入内淋巴液，导致球囊和椭圆囊中的耳石无法形成[4]，从而无法感受直线加速度运动的刺激。目前有关PMCAs在内耳的研究主要集中在耳蜗，其在前庭的研究甚少[4]。因此，本研究拟通过检测新生大鼠前庭器官(椭圆囊斑和球囊斑)PMCA1～4的A端和C端剪接体的表达，为更深入地研究其在前庭器官的功能提供参考，同时为治疗与PMCAs有关的内耳疾病(如PMCA2基因突变所致的耳聋)提供新的思路。

1　材料与方法

1.1实验动物选择出生后第2天的健康SD大鼠10只，无中耳感染、耳毒性药物应用及强噪声暴露史。所有动物由华中科技大学同济医学院动物中心提供，实验都经过华中科技大学同济医学院动物委员会同意，具备实验合格证书。

1.2主要试剂和仪器Trizol (Invitrogen，美国)，逆转录试剂盒(TOYOBO，日本)，反转录试剂盒(TOYOBO， 日本)，PCR 引物(上海生工公司)，GelDoc XR 凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)，PCR 仪(美国Bio-Rad公司)，显微解剖镊(瑞士Dumont公司)，解剖显微镜(日本Nikon 公司)。

1.3实验方法

1.3.1球囊及椭圆囊取材取10只新生大鼠颈椎脱臼法处死，打开前庭窗，用分离针沿前庭窗后下缘挑开前庭外侧骨壁，充分暴露前庭池内的球囊。用微细分离针首先在球囊的前缘划开骨膜，沿球囊背侧与前庭内侧壁之间紧贴骨壁直至分离，直至整个球囊游离，用微细分离针挑开球囊的囊壁并轻轻挑除耳石膜取出球囊斑。同法取椭圆囊斑。

1.3.2逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)Trizol法提取总RNA，按照 TOYOBO 逆转录试剂盒逆转录为 cDNA，然后以cDNA为模板，行聚合酶链反应。PMCA1～4的A端和C端剪接体引物见引文[2，5，6]。PMCA1～4的A端剪接体引物如下。PMCA1：F，5′-TAGGCACCTTTGTGGTGCAG-3′，R，5′-CGGCTCTGAATCTTCTATCC-3′；PMCA2：F，5′-GAAAGCTCGCTCACAGGGGAG-3′, R,5′-ACCCATGGTCTCACAGGCG-3′；PMCA3：F，5′-CATGTCATGGAAGGTTCTGG-3′，R ,4′-GTTATTGTCCTTCATCATTTTCTT-3′；PMCA4：F，5′-GTGACTGCTGTG GGAATCAA-3′，R，5′-GTTGTTGTCCTTCATCATTTTCTT-3′；PMCA1～4的C端剪接体引物如下。PMCA1: F, 5′-TAGGCACCTTTGTGG TGCAG-3′,R，5′-CGGCTCTGAATCTTCTATCC-3′; PMCA2: F, 5′-AAGATCCACGGCGAGCGTAAC-3′, R, 5′-GCTCG AGTTCTGCTTGAGCGC-3′;PMCA3: F, 5′-GTCCAATTTGGAGGGAAGCC-3′, R, 5′-CGTTGTTGTTCTGGTT AGGG-3′; PMCA4, F, 5′-ATGCCGA GATGGAGCTTCGC-3′, R, 5′-CAGCATCCGACAGGCGCTTG-3′。内参为β-actin: F, 5′-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3, R, 5′-TCTGCTGGAAGGTGGACAGT-3′。PCR循环条件：预变性95 ℃5分钟，变性94 ℃45秒，退火55～60 ℃45秒，延伸72 ℃45秒，终末延伸72 ℃10分钟(变性、退火、延伸共计30个循环)；所得产物5 μl在2%的琼脂糖凝胶中电泳，在GelDoc XR凝胶成像系统下成像。

2　结果

2.1PMCA1～4的A端和C端剪接变异体在新生大鼠椭圆囊斑的表达在椭圆囊斑(U)样本，PCR引物在PMCA1的A端和C端分别扩增出519 bp和430 bp大小的条带(图1)，分别称为剪接体x和b；在PMCA2的A端和C端分别扩增出762 bp和552 bp、325 bp大小的条带(图2)，分别称为剪接体w和a、b，其中b的表达较弱；在PMCA3的A端和C端分别扩增出521 bp和646 bp、492 bp、579 bp大小的条带(图3)，分别称为剪接体z和a、b、c；在PMCA4的A端和C端分别扩增出524 bp、488 bp和260bp大小的条带(图4)，分别称为剪接体x、z和b。

2.2PMCA1～4的A端和C端剪接变异体在新生大鼠球囊斑的表达在球囊斑(S)样本，PCR引物在PMCA1的A端和C端分别扩增出519 bp和430 bp大小的条带(图1)，分别称为剪接体x和b；在PMCA2的A端和C端分别扩增出762 bp和552 bp、325 bp大小的条带(图2)，分别称为剪接体w和a、b，其中b的表达较弱；在PMCA3的A端和C端分别扩增出521 bp和646 bp、492 bp、579 bp大小的条带(图3)，分别称为剪接体z和a、b、c；在PMCA4的A端和C端分别扩增出524 bp、488 bp和260 bp大小的条带(图4)，分别称为剪接体x、z和b。

3　讨论

在内耳，前庭系统的生理功能对维持身体平衡非常重要，而Ca2+参与维持前庭平衡功能[4]。PMCA在未激活状态下对Ca2+的亲和力很低(平衡解离常数Kd约为10 μM)，不具备清除细胞内Ca2+的能力，因此，需要启动一些机制来提高它与Ca2+的亲和性。通过调节PMCA结构上的两个位点可激活其钙泵功能，其中一个位点位于PMCA胞质尾端的C末端(C端)[7]，通过它可以调节PMCA与钙调节蛋白(calmodulin)的亲和性，而钙调节蛋白是最早被发现的激活剂[8,9]，能将Ca2+的Kd从10 μM降到200 nM；另一个位点是位于PMCA胞质区的第一个结构环(A端)[10]，磷脂类物质对它的激活作用甚至强于钙调节蛋白，能将Ca2+的Kd从10 μM降到100 nM[11]。PMCA1～4的A端和C端均存在不同的剪接方式[2]，其中A端由含33、36、39、42和60个核苷酸的外显子以不同的组合形式剪接而成，产生剪接体w、x、y和z；C端的剪接方式更复杂，由含55、68、87、88、114、154、172和178个核苷酸的外显子以不同的组合形式剪接而成，产生剪接体a、b、c、d、e和f。PMCA1～4的A端和C端的剪接形式影响其排钙能力。

图1RT-PCR方法检测PMCA1在新生大鼠前庭椭圆囊斑(U)和球囊斑(S)表达电泳图

在PMCA1的A端，U和S均扩增出一条 519 bp大小的条带，称为剪接体x；在PMCA1的C端，U和S均扩增出一条430 bp大小的条带，称为剪接体b。左侧条带为标记物Marker。β-actin为内参条带

图2RT-PCR方法检测PMCA2在新生大鼠前庭椭圆囊斑(U)和球囊斑(S)表达电泳图

在A端, U和S均扩增出一条762 bp大小的条带，称为剪接体w；在C端， U和S均扩增出两条 552 bp和325 bp 大小的条带，分别称为剪接体a和b，其中b的表达量较弱。左侧条带为标记物Marker。β-actin为内参条带

图3RT-PCR方法检测PMCA3在新生大鼠前庭椭圆囊斑(U)和球囊斑(S)表达电泳图

在A端, U和S均扩增出一条521 bp大小的条带，称为剪接体z；在C端， U和S均扩增出三条646 bp、492 bp和579 bp大小的条带，分别称为剪接体a、b和c。左侧条带为标记物Marker。β-actin为内参条带

图4RT-PCR方法检测PMCA4在新生大鼠前庭椭圆囊斑(U)和球囊斑(S)的表达电泳图

在A端, U和S均扩增出两条524 bp和488 bp大小的条带，称为剪接体x和z；在C端， U和S均扩增出一条260 bp大小的条带，分别称为剪接体b。左侧条带为标记物Marker。β-actin为内参条带

PMCA1和PMCA2是表达于前庭毛细胞的两种主要PMCA亚型，其表达的剪接体类型也有报道[12,13]。由于前庭毛细胞缺少Na/Ca交换体，因此，其主要依靠PMCA1和PMCA2排出细胞内的钙离子，保证前庭毛细胞发挥正常的生理功能。最新研究发现PMCA2的表达水平随着听觉系统的发育成熟逐渐升高[14]，PMCA2结构上的一个新的突变位点dfwi5 联合Cdh23突变可导致耳聋和平衡功能失调[15]，进一步证实了PMCA2在耳蜗和前庭发挥重要的作用。有关PMCA3和PMCA4在前庭器官的表达也有少量报道[12]，但PMCA3和PMCA4的剪接体在哺乳动物前庭器官的表达尚不明确，PMCA3可能参与神经递质释放的调控，PMCA4可能参与协助其他PMCA亚型发挥作用[13]。

本研究结果显示新生大鼠前庭器官的椭圆囊斑和球囊斑表达的PMCA1～4的A端和C端剪接体类型一致，均为PMCA1x/b, PMCA2w/(a、b)，PMCA3z/(a、b、c)和PMCA4 (x、z)/b。有研究证实，在大鼠前庭器官，PMCA1主要表达在前庭毛细胞侧膜，PMCA2主要表达在前庭毛细胞纤毛[16]。结合本研究，可以推测PMCA2w/(a、b)是表达于大鼠前庭毛细胞纤毛的剪接体，PMCA1x/b是表达于前庭毛细胞侧膜的剪接体。为了探讨不同类型的剪接体之间的功能差异，有学者将携带z/a、z/b、w/a和w/b的质粒体外转染中国仓鼠卵巢细胞，然后观察其对ATP所激发的短暂的胞内Ca2+电流的峰值及Ca2+浓度恢复到正常水平速度的影响，结果发现z/a、z/b和w/b的排钙能力无明显差异，相比而言，w/a对Ca2+内流的快速反应能力较差，但它在基础Ca2+水平时的排钙能力较强[16]。值得注意的是，大鼠耳蜗毛细胞纤毛表达的主要剪接变异体是PMCA2 w/a[17]，而本研究发现前庭毛细胞纤毛表达的剪接体也以PMCA2w/a为主，w/a的这种功能特点符合毛细胞对Ca2+的需求，即在静息状态下毛细胞纤毛保持低Ca2+水平，从而保证其具有最佳的机械电转导敏感性。PMCA2突变的小鼠出现平衡功能障碍[4]，结合PMCA2w/a在基础Ca2+水平时排钙能力较强的特点，推测w/a与大鼠发育中前庭囊斑耳石的形成有密切关联。从本研究结果看新生大鼠前庭毛细胞表达的PMCA2的C端剪接体主要是a, 此外还有少许b, 这和Dumont 在成年牛蛙和大鼠感觉上皮毛细胞纤毛的发现相似[12]。毛细胞纤毛偏向“选择”剪接体2a，可能是因为2a与2b在结构上的CaM-BD氨基酸序列不同，2a自我抑制状态较2b不稳定，故2a与Ca2+-钙调蛋白的亲和力低于2b。毛细胞纤毛间不断进行着机械电转导过程，纤毛内Ca2+浓度变化频繁，剪接体2a与钙调蛋白的亲和力低于2b，对钙调蛋白的依赖性低，在钙调蛋白缺如的情况下也可以起作用[18]。

PMCAs的剪接体与PMCAs在极性细胞的定位有一定的关系。剪接体PMCA1x参与其顶端定位，将PMCA1x/b的剪接体b剪切掉后，PMCA1由原来的侧膜定位变成在顶膜、侧膜表达[19]，从而可以解释PMCA1x/b表达在毛细胞胞膜(顶膜和侧膜区域)。PMCA1可以通过C末端(即剪接体PMCA1b)与细胞侧膜区域PDZ-domain(PSD95/D1g/ZO-1的缩写，PSD是突触后致密蛋白，ZO-1是紧密连接蛋白-1，基因discs large编码的蛋白称D1g蛋白)结合从而介导其与多种蛋白作用，使之二聚化激活其活力，PDZ-protein有质膜鸟苷酸激酶(MAGUK)家族、胁道相关蛋白(SAP)、钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(CASK)、Na+/H+交换体调节因素2、PISP、Ania3/Homer protein(Homer蛋白Ania3)[20]。PMCA2 在极性细胞的顶膜定位由其A 端剪接体决定，与 C 端剪接体无关。剪接体w决定PMCA2 在极性细胞的顶膜定位，如毛细胞[12]以及乳腺上皮细胞[21]，而z 决定PMCA2 在细胞胞体侧膜定位[1,19]。

目前有关PMCA1和PMCA2在内耳的分布及功能方面的研究较多，但有关PMCA3和PMCA4在内耳的研究很少。PMCA3的表达局限，主要分布在大脑脉络膜血管丛[22]和骨骼肌[23]。在内耳，有学者通过原位杂交方法检测到PMCA3在出生至成年大鼠的耳蜗-前庭神经元表达[6]，但PMCA3在前庭组织表达的剪接体类型尚不清楚。本文首次报道新生大鼠前庭上皮表达的PMCA3的A端和C端剪接体分别为z和a、b、c；而在新生大鼠耳蜗， PMCA3表达的C端剪接体也为a、b和c[6]，这说明PMCA3在耳蜗和前庭表达的剪接体类型一致。PMCA4是一种管家基因，表达于很多类型的细胞[24]，PMCA4除了发挥防止Ca2+超载的基本功能外，也在特定的组织发挥着特殊的功能，比如参与精子活性、平滑肌收缩功能的调节及B淋巴细胞和其他组织内的Ca2+信号调控[4]。PMCA4在发育中的耳蜗组织中表达非常微弱，只在出生后第12天的耳蜗内毛细胞有短暂的高表达[6]；本研究首次发现PMCA4在新生大鼠椭圆囊斑和球囊斑表达的剪接体为PMCA4 (x、z)/b；膜相关鸟苷酸激酶家族的成员通过PDZ区域介导的相互反应与PMCA4b关联[25]，PMCA4b是一氧化氮合酶1(NOS-1)的负调控因子，这种生理活动的开始同时需要PMCA4的Ca2+转运活动和介于PMCA4b和NOS-1之间的PDZ区域介导的反应[26]。目前尚无研究发现PMCA3和PMCA4与前庭平衡功能直接关联，但不排除它们协助PMCA2维持前庭平衡功能。

PMCA 的四种亚型在同一种属中有75%～85%的同源性和85%～90%的相似性[27]，它们的主要功能基本相同，即将细胞内的钙离子排到细胞外，这些PMCA 亚型共同的结构是该钙泵基本的组成部分，而PMCA不同的剪接体则可能与各个钙泵的特异功能有关，从而满足不同的组织或细胞的生理需求。尽管最近几年有关PMCAs 的研究有了很大的进展，但仍远远不够，PMCA 的3D结构的阐明还没有实质性进展；随着PMCAs 在不同组织、细胞甚至细胞某个区域中所发挥的作用引起越来越多的关注，相信以后有关 PMCA 1～4及其剪接体在内耳发挥的功能将得到更充分的认知。

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(2016-02-16收稿)

(本文编辑周涛)

The Expression of Plasma Membrane Ca2+-ATPase Isoforms 1～4 and the Splice Variants at Sites A and C in the Neonatal Rat Vestibular Organ

Luo Mi*, Chu Hanqi, Tao Yanling, Zhou Liangqiang, Chen Jin,Liu Yun, Pan Chunchen, Chen Qingguo

(*Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, 430030，China)

ObjectiveTo study the expression of plasma membrane Ca2+-ATPase isoforms 1-4 and the splice variants at sites A and C in the neonatal rat vestibular organ. MethodsTen rats at postnatal 2 days (P2) were decapitated and their vestibular organs (macula utriculi and macula sacculi) were isolated. The total proteins of the vestibular organs were extracted. The expression of PMCA1-4 splice variants at sites A and C was detected by RT-PCR. ResultsThe splice variants of PMCA1-4 at sites A and C in macula utriculi and macula sacculi of neonatal rat vestibular organs were PMCA1x/b, PMCA2w/(a，b)，PMCA3z/(a,b,c)and PMCA4 (x,z)/b.ConclusionThe splice variants at sites A and C among PMCA1, PMCA2, PMCA3 and PMCA4 were different in the vestibular organs of neonatal rats, which could be explained that macula utriculi and macula sacculi had different requirements of Ca2+turning for these PMCA isoforms.

Plasma membrane Ca2+-ATPase isoforms 1～4;Splice variants；Macula utriculi；Macula sacculi

△国家自然科学基金青年基金资助(81300827)

1华中科技大学同济医学院附属同济医院耳鼻咽喉-头颈外科(武汉430030)；2湖北文理学院附属襄阳市中心医院耳鼻咽喉-头颈外科

罗蜜，女，湖北人，住院医师，主要研究方向为听觉生理。

陈请国(Email:cqg198292@126.com)

10.3969/j.issn.1006-7299.2016.05.013

R764.3

A

1006-7299(2016)05-0473-05

网络出版时间：2016-6-2916：16

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20160629.1616.070.html