含氧气调包装对牦牛肉肉色稳定性的影响

马骋，梁琪*，文鹏程, 张炎

1(甘肃农业大学 食品科学与工程学院，甘肃 兰州，730070)2(甘肃省功能乳品工程实验室，甘肃 兰州，730070)



含氧气调包装对牦牛肉肉色稳定性的影响

马骋1,2，梁琪1,2*，文鹏程1,2, 张炎1,2

1(甘肃农业大学 食品科学与工程学院，甘肃 兰州，730070)2(甘肃省功能乳品工程实验室，甘肃 兰州，730070)

探究在不同含氧气调包装方式中影响牦牛肉肉色稳定性的因素。以牦牛背最长肌为试验材料，采用真空包装为对照组，以O2含量为40%、60%、80%，CO2含量为60%、40%、20%的三种不同含氧气调包装组为试验组，在0～4 ℃的贮藏条件下，每隔4天，对各包装组中牦牛肉的肉色、肌红蛋白百分含量、硫代巴比妥酸值(TBA值)、乳酸脱氢酶活性(LDH活性)、还原型辅酶Ⅰ(NADH)含量及高铁肌红蛋白还原酶活性(MRA活性)进行测定。结果表明：与真空包装组相比，含氧气调包装组更利于良好肉色的形成。O2含量为60%的气调包装组中牦牛肉的肉色稳定性最好，且LDH活性和NADH含量较高。根据指标间相关性分析得出，LDH活性和NADH含量与a*值和OMb%呈显著正相关(P<0.05)。因此，LDH活性和NADH含量是影响各包装组牦牛肉肉色稳定性的主要因素。

牦牛肉；气调包装；肉色稳定性；NADH含量；乳酸脱氢酶活性

冷鲜肉的色泽保持时间很短，是影响肉品货架期的决定性因素之一。研究表明，绝大多数消费者对牛肉的购买欲取决于肉色，而非其他食用品质[1]。肉的色泽主要与还原型肌红蛋白(deoxymyoglobin, DMb)、氧合肌红蛋白(oxymyoglobin, OMb)和高铁肌红蛋白(metmyoglobin, MMb)3种蛋白的含量及相对比例有关。MURPHY等[2]报道，当肉品中的肌红蛋白主要以OMb存在时，呈现消费者喜爱的鲜红色，当MMb%达到20%时，会使表观肉色发暗，影响肉的销售量。VENTURINI等[3]研究得出，DMb的氧化速率比OMb更快，DMb在低氧条件下更易被氧化为MMb。KIM等[4]指出，乳酸脱氢酶通过再生NADH在MMb还原过程中发挥一定作用，有利于肉色稳定性的维持。

气调包装技术[5](modified atmosphere packaging，MAP) ，是用高阻隔性的包装材料使肉品处于与空气气体组成不同的环境中，通过保护良好肉色、抑制微生物生长，从而延长产品货架期的一种技术。有研究表明，适宜的气调包装方式可明显延长肉品的货架期至16 d以上[6-8]。XIN等[9]研究得出，在肉色稳定性方面，高氧气调包装的肉制品显著优于真空包装的肉制品。

对牦牛肉而言，由于其产地位于高海拔、低气压的高寒高山草原[10]，运输时间长，因此，对牦牛肉护色技术的相关研究显得尤为重要。目前，关于不同含氧气调包装中有关酶系对牦牛肉肉色变化的影响还未见报道。本文通过对各含氧气调包装方式下的牦牛肉的肉色及相关酶系的研究，以期获得在各气调包装方式中影响牦牛肉肉色稳定性的因素，为更好的利用包装提高牦牛肉肉色稳定性。

1　材料与方法

1.1主要材料与试剂

牦牛背最长肌：随机选取甘肃甘南藏族自治州玛曲县的3～5岁健康放牧牦牛8头进行屠宰试验。禁食12～24 h，禁水2 h，屠宰后立即取背最长肌。

包装气体：O2、CO2(均为食品级)(兰州众利化工气体有限公司)。

包装材料：规格为(16 cm×24 cm)的PE复合真空包装袋。

试验试剂：NaHPO4、NaH2PO4、K2HPO4、KH2PO4、乙醇、NaOH、半胱氨酸、丙酮酸钠为分析纯试剂；NADH(还原型辅酶Ⅰ)、MTT(噻唑蓝)、PMS(聚α-甲基苯乙烯)、肌红蛋白为上海源叶生物科技有限公司生产；乙醇脱氢酶为Sigma试剂公司生产。

1.2主要仪器与设备

DQB-360W多功能气调包装机(上海青葩包装机械公司)；QHZ-5气体混合装置 (上海青葩包装机械公司)；AL 204 电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；HP-200 色差仪(上海汉谱光电科技有限公司)；testo 205 便携式pH计(德图仪表(深圳)有限公司)；XHF-D 高速分散器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；TGL-20M 高速台式冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；754PC 紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；PHS-3C pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；DZ-450A 真空包装机(温州市大江真空包装机械有限公司)。

1.3实验方法

1.3.1原料处理及试验设计

将原料肉去除筋膜，切分成100 g左右的肉块。所有与肉接触的案板、刀具等用体积分数75%的乙醇消毒后，放于紫外灯下照射30 min。将切分好的肉块装于PE复合真空包装袋中，各处理组气体组分如表1所示。将包装好的肉样放于0～4 ℃保藏，每隔4 d对各组肉样进行色差值、肌红蛋白含量、脂肪氧化程度、乳酸脱氢酶活性、NADH含量和高铁肌红蛋白还原酶活性的测定。

表1　气调包装气体组分

1.3.2色差值的测定

用色差仪测定肉样的L*、a*、b*值，每个肉样测定3次取平均值。

1.3.3肌红蛋白含量的测定

参考KRAZYWICKI[11]的方法，并稍作改动。随机取处理过的绞碎肉样2 g，加入20 mL浓度为0.04 mol/L、pH 6.8的磷酸钠缓冲剂。20 ℃、10 800 r/min高速匀浆20 s，冰浴中放置1 h。10～15 ℃、10 000 g下离心30 min，取上清液，用滤纸过滤，同种缓冲液补足至25 mL，分别测定补足后样品在525、545、565和572 nm处的吸光值。

氧和肌红蛋白(OMb)/%=(0.882Rl-1.267R2+0.809R3-0.361)×100

(1)

高铁肌红蛋白(MMb)/%=(-2.541Rl+0.777R2+0.800R3+1.098)×100

(2)

式中:Rl、R2和R3分别是吸光度的比值：A572/A525、A565/A525和A545/A525。

1.3.4TBA值的测定

参照MARIANNE等[12]的方法，并稍作改动。取10 g肉样绞碎，加50 mL 7.5%的三氯乙酸(含0.1%EDTA)，振摇30 min，双层滤纸过滤2次。取5 mL上清液加入5 mL 0.02 mol/L TBA溶液，100 ℃下水浴40 min，取出冷却1 h后1 600 g离心5 min，上清液中加入5 mL三氯甲烷摇匀静置分层后，取上清液分别在532 nm和600 nm处比色，记录消光值并按公式(3)计算TBA值。

(3)

与TBA反应的物质的量以每千克肉中丙二醛的质量(mg)来表示。

1.3.5乳酸脱氢酶(LDH)活性的测定

参考UMRAN[13]的方法并稍作改动。取6.0 g肌肉组织，用组织捣碎机捣碎后，加入24 mL，4 ℃预冷的10 mmol/L(pH 6.5)的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液，冰浴匀浆3次，每次10 s。将匀浆好的样品于4 ℃，13 823 g下离心30 min，用滤纸过滤后取上清液。将上清液用0.1 mol/L，pH 7.5的K2HPO4-KH2PO4缓冲液稀释适当倍数，取10 μL经稀释的上清液加入至由2.9 mL丙酮酸钠溶液和0.1 mL NADH溶液组成的反应液中。空白组由3 mL，0.1 mol/L，pH 7.5的K2HPO4-KH2PO4缓冲液组成。340 nm处测定样品在反应过程中吸光度的变化，每隔0.5 min测定1次，连续测3 min。以A对时间作图，取反应最初线性部分计算△A340。利用公式算出乳酸脱氢酶活性(LDH活力单位U/mL=△A340×稀释倍数×100)。乳酸脱氢酶活力单位定义：25 ℃，pH 7.5条件下，每分钟A340下降值为1.0的酶量为一个单位。

1.3.6NADH含量的测定

参考KLINGENBERG[14]和孙京新[15]的方法。将肉样绞碎，取1.0 g肉样与4 mL，0.02 mol/L NaOH(含0.5 mmol/LL-半胱氨酸)的溶液混合，60 ℃避光萃取10 min，加入3 mL 500 mmol/L pH 8.0的磷酸盐缓冲液，13 000 g离心3 min，取上清液。制备100 mmol/L，pH 8.0的磷酸缓冲液(含 1.0 mmol/L噻脞蓝(MTT)，2 mmol/L N-甲基-吩嗪甲基硫酸盐(PMS)，2 IU 乙醇脱氢酶，200 mmol/L乙醇)为 NADH 反应液；取此反应液2.4 mL加到600μL上清萃取液中或1 mmol/L NADH 标准稀释液(500 mmol/L pH 8.0 磷酸缓冲液)中，反应液2.4 mL加到 600μL 500 mmol/L pH 8.0 磷酸缓冲液作为空白对照，反应 5 min，测定570 nm 处的吸光度变化。结果表示为 nmol/g 样品。

1.3.7高铁肌红蛋白还原酶活性的测定

1.3.7.1高铁肌红蛋白还原酶的提取方法

参照SAMMEL等[16]的方法并改进。将贮存于-80 ℃的背最长肌样品于4 ℃解冻至半冻状态，除去表皮脂肪和筋膜，将肉样绞碎。准确称取10 g样品加入20 mL冰提取液，4 ℃条件下，用组织分散器连续均质处理1 min，均质液于4 ℃，10 203 g下离心20 min，得到上清液经中速定性滤纸过滤除去脂肪，滤液中氧合肌红蛋白用稍过量的铁氰化钾氧化后，再用冰提取液于4 ℃条件下透析(透析袋截留相对分子质量为14 000)24 h，期间换液5 次，为除去过量的高铁氰化钾。透析完毕后于4 ℃，14 692 g下离心20 min，取上清液用pH 7.0，2.0 mmol/L的磷酸盐缓冲液定容至20 mL，-80 ℃贮藏备用。

1.3.7.2高铁肌红蛋白还原酶活力的测定

参照高娜[17]等人的方法。配制标准高铁肌红蛋白还原酶反应体系，成分如表2所示，空白对照以去离子水代替NADH，其他反应组分不变。

反应前30 min将各反应物置于25 ℃恒温水浴锅中，使反应体系温度维持在25 ℃。待体系中加入NADH后启动反应，用紫外-可见分光光度计在580 nm处测定吸光度值，两者摩尔消光系数为12×103L/(mol·cm)。高铁肌红蛋白还原酶活力单位定义为U。重复3 次。酶活力计算见公式(4)。

(4)

式中：ΔA为每分钟吸光度的变化；V为反应体系体积，mL；ε为摩尔消光系数，L/(mol·cm)；V为样品体积，mL；l为比色杯光径，cm；m为样品的质量，g；109为mol换算成nmol。

表2　高铁肌红蛋白还原酶活性测定的反应组分

注：1) 50 ℃水浴保温 10 min；重复样本：n=3。

2　结果与分析

2.1不同包装方式对牦牛肉肉色的影响

表3　不同包装方式对牦牛肉肉色的影响

注：同列不同小写字母表各处理组间差异显著；同行不同大写字母表不同贮藏天数间差异显著。

各包装组中牦牛肉肉色的变化规律如表3所示。在16 d的贮藏期中，4种包装组中牦牛肉的L*值均呈先上升后下降的趋势，且在第8天时达最大值。显著性分析显示，除第8天和第12天外，各气调包装组中的L*值均显著高于真空包装组(P<0.05)，这可能与真空包装形成了较多的DMb致使肉色较暗有关[18]。各气调包装组中牦牛肉的a*值呈波动变化，且在第8 d时达最大值。在贮藏的前8 d，各气调包装组中的a*值均显著高于真空包装组(P<0.05)。在3个气调包装组中，含氧量为40%的MAP1组的a*值始终低于其他2个气调包装组，且在第12天后呈显著下降趋势(P<0.05)，含氧量为80%的MAP3组的a*值虽在第8 d时显著高于其他各处理组(P<0.05)，但第12天时呈显著下降趋势(P<0.05)，而含氧量为60%的MAP2组的a*值却始终处于较高状态且变化稳定。综合以上结果说明，含氧量为40%和80%的气调包装组对牦牛肉肉色稳定性的维持不及含氧量为60%的气调包装组。各包装组中牦牛肉的b*值在贮藏过程中呈上升趋势，8 d以前，真空包装组和含氧量较低的MAP1组的b*值显著高于含氧量较高的MAP2和MAP3组(P<0.05)。8 d以后，3组气调包装组中的b*值呈显著上升趋势(P<0.05)，且都显著高于真空包装组(P<0.05)，第16天时，各包装组间的b*值差异显著，且随着氧含量的升高b*值呈上升趋势。

综合L*、a*、b*值得出，在整个贮藏过程中，MAP2(60%O2+40%CO2)组始终有较高的L*、a*值和较低的b*值，更有利于牦牛肉形成消费者喜爱的鲜红色。

2.2不同包装方式对牦牛肉肌红蛋白含量的影响

由图1可知，在整个贮藏过程中，各气调包装组中的OMb%呈先上升后下降的趋势，且在第8天达最大值；而真空包装组中的OMb%始终呈下降趋势，这与真空包装形成的无氧环境使肌红蛋白转化为DMb有关。同时，所有气调包装组中的OMb%都显著高于真空包装组(P<0.05)，这与YULONG等[19]指出的高的O2浓度可以促进消费者喜爱的樱桃红色的OMb的形成的结论一致。与a*值的变化规律相似，含氧量为40%的MAP1组的OMb%显著低于MAP2和MAP3组(P<0.05)，这可能与该氧含量不利于OMb大量形成有关。在贮藏的前8天，氧含量为80%的MAP3组的OMb%高于其他各包装组，但在贮藏后期下降较快，说明该气体组分不能有效维持OMb稳定性。在所有包装组中，含氧量为60%的MAP2组中的OMb%一直处于较高状态且保持稳定，说明该气体组分最有利于OMb的形成和维持。

图1　不同包装方式对牦牛肉OMb含量的影响Fig.1　Effects of different packaging methods on the content of OMb of yak meat

由图2可知，在整个贮藏过程中，真空包装组和MAP2组中的MMb%变化稳定，MAP1组和MAP3组中的MMb%呈上升趋势。其中，MAP1组中的MMb%呈显著上升趋势(P<0.05)，且在第8天以后显著高于其他包装组(P<0.05)，这可能与相对较低的氧含量不能使大部分的肌红蛋白处于OMb的状态，而是处于不稳定的DMb的状态，在有氧条件下，DMb很容易氧化成MMb有关[3]。MAP3组中的MMb%在贮藏前期相对稳定，在贮藏后期上升较快，这可能与该组分下包装的牦牛肉的还原酶活性在贮藏后期下降较快，对MMb的还原力减弱有关。

图2　不同包装方式对牦牛肉MMb含量的影响Fig.2　Effects of different packaging methods on the content of MMb of yak meat

2.3不同包装方式对TBA值的影响

由图3得出，随贮藏时间的延长，各包装组牦牛肉中的TBA值均呈上升趋势。其中，真空包装组的TBA值上升较慢，且基本保持稳定，这与真空包装形成的无氧环境有关。贮藏的前8 d，真空包装组和含氧量较少的MAP1组中的TBA值高于含氧量较高的MAP2和MAP3组，这可能与0～8 d时包装内较高的氧分压激活了肉中与脂肪有关的抗氧化酶活性，使脂肪氧化速度减慢有关[20]。8 d以后，MAP2和MAP3组中的TBA值呈快速上升趋势，这可能与8 d后牦牛肉中的抗氧化酶活性降低，包装中大量的氧气使脂肪快速氧化有关。第16天时，各包装组的TBA值间差异显著(P<0.05)，且随着包装中氧含量的升高，TBA值呈上升趋势。

图3　不同包装方式对牦牛肉TBA值的影响Fig.3　Effects of different packaging methods on the TBA value of yak meat

2.4不同包装方式对乳酸脱氢酶(LDH)活性的影响

随贮藏时间的延长，各包装组牦牛肉中的LDH活性呈下降趋势。其中，真空包装组中的LDH活性呈先快速下降后缓慢下降的趋势，12 d以后，其LDH活性高于其他各包装组，这可能与乳酸脱氢酶在无氧条件下更易合成有关[21]。MAP2组和MAP3组中的LDH活性呈先缓慢下降后快速下降的趋势。显著性分析显示，在0～12 d的贮藏期内，氧含量为60%的MAP2组中的LDH活性显著高于其他2个气调包装组(P<0.05)，说明LDH活性在该气调组分中获得较好维持。

图4　不同包装方式对牦牛肉乳酸脱氢酶活性的影响Fig.4　Effects of different packaging methods on the LDH activity of yak meat

2.5不同包装方式对NADH含量的影响

由图5可知，0～4 d时，各包装组牦牛肉中的NADH含量呈略微上升趋势，这可能与0～4 d时肌肉中发生糖酵解反应产生乳酸，利于NADH的生成有关[22]。4 d以后，各包装组中的NADH含量呈快速下降趋势，这可能与该阶段NADH的消耗速率大于生成速率有关。整个贮藏过程中，真空包装组中的NADH含量一直处于最高状态，且在12 d以后显著高于其他气调包装组(P<0.05)，这与真空包装形成的无氧环境抑制了包装中牦牛肉生化反应的进行，使NADH消耗较少有关。除第8天外，在整个贮藏过程中，MAP1组和MAP2组中的NADH含量间差异不显著(P>0.05)，说明氧含量在40%～60%时，对牦牛肉中NADH含量影响不显著。MAP3组中牦牛肉的NADH含量一直处于所有包装组中的最低值，且在第12天后显著低于其他各包装组(P<0.05)，这与过高的氧含量使NADH大量消耗有关。

图5　不同包装方式对牦牛肉NADH含量的影响Fig.5　Effects of different packaging methods on the NADH content of yak meat

2.6不同包装方式对高铁肌红蛋白还原酶(MRA)活性的影响

如图6所示，各包装组牦牛肉中的MRA活性都呈下降趋势，且各包装组间该值差异显著(P<0.05)。其中，真空包装组中的MRA活性变化最稳定，且在贮藏的16 d中，始终显著高于其他各包装组(P<0.05)，说明真空包装形成的无氧环境对MRA活性有较好的保持作用。气调包装组中的MRA活性下降速度较快，且包装中氧含量越高，MRA活性越低，这可能与包装中氧含量越高，包装中牦牛肉的脂肪氧化程度越高，氧化产物抑制了MRA活性有关。

图6　不同包装方式对牦牛肉MRA活性的影响Fig.6　Effects of different packaging methods on the MRA activity of yak meat

2.7各指标间相关性分析

由表4可知，OMb%与L*值和a*值呈极显著正相关性(P<0.01)，说明OMb含量的升高对牦牛肉的亮度值和红度值均有积极作用。TBA值与b*值呈极显著正相关性(P<0.01)，说明b*值的升高与脂肪氧化密切相关。同时，TBA值与a*值呈显著负相关性(P<0.05)。LDH活性和a*值及OMb%呈显著正相关(P<0.05)，与MMb%呈显著负相关，说明LDH有利于OMb%的形成和肉色稳定性的维持，这与陈景宜等[23]的结论一致。NADH含量与LDH活性呈极显著正相关性(P<0.01)，与a*值和OMb%呈显著正相关性(P<0.05)，说明NADH对OMb的形成有促进作用。同时，NADH含量与b*值和TBA值呈极显著负相关性(P<0.01)，这可能与牦牛肉中NADH含量的升高使牦牛肉的整体抗氧化能力增强，进而抑制脂肪氧化有关，这与KIM等[24]的研究结果相同。MRA活性和LDH活性及NADH含量呈极显著正相关性(P<0.01)，与b*值和TBA值呈极显著负相关(P<0.01)。与KING等[25]研究所得的MRA与OMb%呈显著性正相关的结论不同，本试验得出，MRA活性与OMb%值无相关性的结论，这可能是因为，在各包装组中，牦牛肉中的NADH含量减小速率明显快于MRA活性的下降速率，而MRA对MMb的还原作用必需在NADH的参与下进行[26]，因而，当NADH含量低于一定限度时，就会对MRA的还原作用产生影响。因此，在各包装组牦牛肉中，NADH含量是良好肉色形成的限制性影响因素。

表4　各指标间相关性

3　结论

(1)含氧量为60%和80%的气调包装组均有利于牦牛肉良好肉色的形成，其中，60%O2的气调包装组对肉色稳定性的维持效果更显著。

(2)牦牛肉的肉色受气体组分、LDH活性、NADH含量多种因素的影响。含氧气调包装组牦牛肉中的OMb%显著高于真空包装组(P<0.05)，使冷藏期间气调包装组中牦牛肉具更好肉色。含氧量为60%的气调包装组中的LDH活性和NADH含量更高，该气体组分下包装的牦牛肉拥有更好的肉色稳定性。LDH活性、NADH含量是影响肉色稳定性的主要因素，其中，NADH是形成良好肉色的限制性因素。

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Effect of modified atmosphere packaging with different oxygen content on color stability of yak meat

MA Cheng1,2, LIANG Qi1,2*, WEN Peng-cheng1,2, ZHANG Yan1,2

1(College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070,China)2(Functional Dairy Product Engineering Laboratory of Gansu, Lanzhou 730070,China)

The objective of this study was to investigate the factors affecting color stability of yak meat in modified atmosphere packaging (MAP) with different oxygen content. In this experiment, the samples of yak meat in vacuum packaging was set as the control group. The experimental group was MAP with 3 different gas components (O2：40%, 60%, 80%; CO2：60%, 40%, 20%). The yak longissimus dorsi muscles were packaged with MAP and vacuum packaging, stored at 4 ℃. The meat color, relative content of myoglobin, TBA values, lactate dehydrogenase (LDH) activity, NADH concentration and metmyoglobin reductase activity (MRA) of yak meat were measured every 4 days. The results showed that, compared with the vacuum packaging, the MAP groups were more conducive to making yak meat having attractive red color. The yak meat in the MAP of 60% O2was the best in color stability, and LDH activity and NADH content were also higher. Meanwhile, both LDH activity and NADH content were positively related witha*value and OMb%(P<0.05). Therefore, LDH activity and NADH concentration were the key factors for color stability of yak meat in all packaging.

yak meat; modified atmosphere packaging(MAP); color stability; NADH content; lactate dehydrogenase (LDH) activity

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609023

硕士研究生(梁琪教授为通讯作者，E-mail : liangqi@gsau.edu.cn)。

国家科技支撑计划(2012BAD28B01)；甘肃省青年基金(1308RJYA019)

2016-01-11，改回日期：2016-03-03