糖原合成酶激酶-3β抑制剂TDZD-8抑制大鼠C6胶质细胞瘤细胞体外增殖及诱导凋亡的作用和机制

汤汉心　林喜容　陈锦镜

(广东省汕头市潮阳区大峰医院神经外科，广东 汕头 515154)



·论著·

糖原合成酶激酶-3β抑制剂TDZD-8抑制大鼠C6胶质细胞瘤细胞体外增殖及诱导凋亡的作用和机制

汤汉心*林喜容陈锦镜

(广东省汕头市潮阳区大峰医院神经外科，广东 汕头 515154)

目的:探讨糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)抑制剂TDZD-8(4-苄基-2-甲基-1，2，4-噻二唑烷-3，5-二酮)对大鼠C6胶质细胞瘤细胞增殖的抑制作用及诱导凋亡的机制。方法：采用MTT方法检测TDZD-8不同浓度(10、20、40和80 μmol/L)处理大鼠C6胶质细胞瘤细胞6、12、24和48 h后对细胞增殖的影响；流式细胞术检测其对细胞凋亡和细胞周期的作用，同时分析凋亡相关基因Bax、Bcl-2和P53的表达变化。结果：TDZD-8浓度、时间依赖性的抑制大鼠C6胶质细胞瘤细胞的增殖(P<0.05)。流式细胞术显示TDZD-8浓度依赖诱导细胞凋亡，其中在20、40和80 μmol/L组有统计学差异(P<0.05)。40和80 μmol/L TDZD-8处理C6细胞后，G0/G1期细胞数量明显增多，分别升高到83%和90%(P<0.05)；而S期和G2/M期细胞数则显著降低(P<0.05)。同时，40和80 μmol/L TDZD-8使Bax和P53表达显著增加，而使Bcl-2表达降低(P均<0.05)。结论：GSK-3β抑制剂TDZD-8可以浓度依赖性抑制C6细胞增殖同时诱导其凋亡，并引起细胞周期阻滞，这可能与其对Bax、P53和Bcl-2的调控相关。

糖原合酶激酶3β；TDZD-8；胶质细胞瘤；细胞增殖；细胞凋亡；细胞周期

糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)是一种丝/苏氨酸磷酸激酶，广泛存在于各种细胞中，在细胞周期调控、基因转录、细胞凋亡及存活、细胞分化等过程发挥重要调控作用。GSK-3β参与调控Wnt，胰岛素通路，NF-Κb，PI3K/Akt等多个信号通路；当其表达异常，将导致异常的生理功能，如胰岛素抵抗、阿尔茨海默病、肿瘤、艾滋病等[1-2]。目前GSK-3β已成为广受关注的新的药物作用靶点。TDZD-8是GSK-3β的特异性小分子抑制物。最近研究报道，GSK-3β抑制剂TDZD-8在体内外模型中抑制胶质细胞瘤[3]，然而其机制还有待进一步研究。为此，本研究探索GSK-3β抑制剂TDZD-8对细胞增殖凋亡及细胞周期的影响，并进一步研究其可能参与的分子机制，为肿瘤药物治疗提供实验依据。

1　材料和方法

1.1实验材料

TDZD-8(4-苄基-2-甲基-1，2，4-噻二唑烷-3，5-二酮)购自美国默克公司，大鼠C6胶质细胞瘤细胞由本实验室传代培养。FACS Calibur flow cytometer 激光流式细胞仪为美国BD公司产品。RPMI 1640培养基购自Gibco公司，新生胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品。碘化乙啶(propidium iodide,PI)周期检测试剂盒及FITC Annexin V凋亡检测试剂盒均购自美国BD Pharmingen。

1.2细胞培养

C6细胞冻于液氮中，实验时进行复苏并培养于含10%(体积分数)新生牛血清，100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素及2 mmol/L L-谷氨酰胺、pH 值为7.2的RPMI 1640培养液中，于37 ℃、5% CO2条件下培养。待细胞生长到80%左右时用0.125%胰蛋白酶消化、传代，选取对数生长期细胞进行实验。

1.3MTT法细胞活性的测定

细胞处理后，换入正常培养基，并加入20 μL 0.5% MTT，轻轻摇匀，培养箱中孵育4 h，吸干培养液，然后加入150 μL DMSO，常温下放置4～5 min后，酶标仪上以570 nm波长测定吸光度。

1.4细胞周期分析

根据细胞活力测定结果，选择TDZD-8处理细胞。收集2×106个细胞，用PBS洗涤2次后，重悬于500 μL的PBS中，加入4 ℃乙醇固定12 h以上。离心除去乙醇，用PBS重悬洗涤，离心去PBS，加入碘化丙啶(PI)染色，室温避光20 min，上流式细胞仪检测DNA含量和细胞周期，资料用Modfit软件分析。每组实验设3个平行样，实验重复3次。

1.5细胞凋亡分析

以不含EDTA的胰酶消化收集1×106个经药物处理的C6细胞，PBS洗涤两次后重悬于binding buffer，加入5 μL的Annexin V-FITC，混匀后再加入5 μL的PI混匀，室温避光反应5～10 min，上机检测细胞凋亡率。每组实验设3个平行样，实验重复3次。

1.6RT-PCR检测Bcl-2基因表达

药物作用48 h后，每组分别收集5孔细胞，用Trizol提取细胞总RNA，DEPC水溶解后，紫外分光光度计DU530准确定量，D260/280≥1.8。提取的总RNA各取2 μg，加入5×第1链buffer 10 μL，10 mol/L的dNTPs 5 μL，RNase抑制剂1 μL，Oligo(dT)18 Primer 10 μL，逆转录酶AMV 2 μL，加无菌三蒸水至总体积20 μL。42 ℃作用1 h，冰浴2 min。PCR扩增Bcl-2、Bax、P53和GAPDH引物分析，见表1。取cDNA 2 μL，依次加入2×premix 10 μL，Bcl-2上下游引物各1 μL，参照基因GAPDH上下游引物各1 μL，加无菌三蒸水至总体积20 μL，置9700型PCR扩增仪扩增。扩增条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 个循环后72 ℃延伸7 min。取PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳，经UV紫外分析仪分析结果。

1.7统计方法

表1　Bcl-2、Bax、P53、GAPDH引物序列

2　结　果

2.1TDZD-8对大鼠C6胶质细胞瘤细胞增殖的影响

大鼠C6胶质细胞瘤细胞经不同浓度的TDZD-8(10、20、40、80 μmol/L)分别处理6、12、24和48 h后，MTT结果显示，与对照组相比，随着TDZD-8浓度的增加及处理时间的延长，细胞增殖抑制作用越明显(P<0.05)，见表2。

表2　TDZD-8浓度依赖地抑制C6的活性

2.2TDZD-8对大鼠C6胶质细胞瘤细胞凋亡的影响

经10、20、40和80 μmol/L TDZD-8处理C6细胞24 h后，细胞凋亡随浓度加大凋亡逐渐增加；其中20、40和80 μmol/L TDZD-8处理组与对照组相比，凋亡分别增加到28%、52%和72%，差异有统计学意义(P<0.01),见图1。

100806040200凋亡率(%)102040800TDZD-8(μmol/L)***

注：与对照组的比较，*P<0.01

图1TDZD处理24 h呈浓度依赖的诱导C6细胞凋亡

2.3TDZD-8对大鼠C6胶质细胞瘤细胞周期的调控

大鼠C6胶质细胞瘤细胞经10、20、40和80 μmol/L TDZD-8处理24 h后，流式分析显示，随着药物浓度的增加G0/G1期细胞逐渐增多，在40、80 μmol/L时分别为83%和90%，而S期和G2/M期细胞逐渐减少。与对照组相比，40和80 μmol/L TDZD-8处理组差异有统计学意义(P<0.01)，见图2。

102040800TDZD-8(μmol/L)100806040200各细胞周期细胞比(%)G0/G1SG2/M**

注：与对照组的比较，*P<0.05

图2TDZD-8处理24 h对C6细胞周期的影响

2.4TDZD-8对凋亡相关因子的影响

TDZD-8作用C6细胞24 h后，呈浓度依赖性上调Bax和P53的表达水平，同时下调Bcl-2的水平，见图3。在40、80 μmol/L时，TDZD-8处理组与对照组比较，Bax分别上升到82%和90%，而Bcl-2分别下降到42%和28%，差异有统计学意义(P<0.01)。P53在20、40、80 μmol/L TDZD-8处理后，分别上升到147%、194%和232%，差异有统计学意义(P<0.01)，见图4。

512138494428375bp5316212737ABkDap53p16p21p27GAPDHp53p16p21p27GAPDH122436480h

注：A：RT-PCR；B：Western

注：与对照组的比较，*P<0.01

图4TDZD-8处理24 h对C6细胞凋亡基因表达的影响

3　讨　论

脑胶质细胞瘤癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，由于胶质细胞瘤的生物学特性十分复杂，恶性程度高，在治疗上容易出现耐药，其治疗效果没有显著的提高。近几年来脑胶质细胞瘤的发病率和死亡率都有明显增高的趋势，因而寻找有效的新的药物靶点成为脑胶质细胞瘤治疗的关键。GSK-3β是一个多功能蛋白激酶，有众多底物，主要通过对酶进行磷酸化从而发挥在多种传导通路中的重要作用。既往研究表明，在结肠癌，前列腺癌，卵巢癌，胃癌等多种肿瘤中GSK-3β表达异常，提示纠正GSK-3β异常表达可能为控制肿瘤发生发展以及治疗中提供了新的思路[4]。

近年来蛋白激酶抑制剂已经成为生物研究的热点，有24个小分子蛋白激酶抑制药物获得批准，还有395个治疗癌症的蛋白激酶抑制剂在进行临床试验。由于GSK-3β的重要生理病理学功能，GSK-3β抑制剂可能成为新的潜在的治疗靶点。Cao[5]等研究发现，通过化学药物抑制GSK-3β的活性后，在体内外均可抑制人卵巢癌细胞的增殖与存活，且高表达的激活型GSK-3β能够诱导肿瘤细胞进入S期，cyclin D1表达增加，促进卵巢癌细胞增殖。Shakoori 等[6]研究报道发现GSK-3β在结肠癌细胞系和患者肿瘤组织中表达增高，对结肠癌细胞系应用GSK3β抑制剂和siRNA，发现细胞增殖受抑制，并诱导细胞凋亡。同样在本的研究中发现，不同浓度的GSK-3β抑制剂TDZD-8对大鼠C6胶质细胞瘤细胞的增殖具有抑制作用，且呈剂量和时间依赖性；同时浓度依赖性诱导细胞凋亡。

目前已知的GSK-3β抑制剂三类，一为Mg2+离子竞争抑制剂即锂离子，作为治疗药物存在一定细胞毒性且治疗量与毒性剂量有交集；二为ATP竞争性抑制剂如马来酞亚胺类和氨基嘧啶类等，这些抑制剂活性较强但是选择性较差，对其他激酶也有一定的抑制活性，毒副作用较大；三为非ATP竞争性抑制剂，如TDZD-8[7]。TDZD-8是化学合成物，可以促进GSK-3β的ser9位点磷酸化进而抑制GSK-3β的活性，但不阻断蛋白激酶A和C(PKA和PKC)，酪蛋白激酶II和依赖细胞周期素激酶1等一系列的激酶的活性，避免了选择性差导致副反应[8]。TDZD-8目前常用于细胞凋亡、阿尔兹海默病、缺血再灌注等研究中。Collino等[9]的研究发现，TDZD-8通过磷酸化GSK-3β的Ser9位点来降低GSK-3β活性，抑制NF-κB和蛋白激酶JNK1/2、p38活性，降低炎症反应及细胞凋亡，减轻脑缺血再灌注损伤。在前列腺癌的研究中，Menschikowski等[10]发现使用GSK-3β抑制剂(TDZD-8和siRNA)处理癌细胞后，能够抑制细胞增殖，降低DNA复制，将细胞周期阻滞于S期,并且引起细胞周期相关因子cdc25，cyclin1和cyclinE表达降低。在本研究中，TDZD-8主要是影响细胞周期向期转变过程，将细胞阻滞在期，抑制其增值并诱导凋亡。

细胞凋亡和周期是高度有序精密的运转过程，其中任何环节出现异常都可导致细胞异常增殖。其中原癌基因Bcl-2蛋白家族与P53是其重要的调节因子。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中最有代表性的抑制凋亡和促进凋亡。Bcl-2可阻止凋亡形成因子如细胞色素C等从线粒体释放出来，具有抗凋亡作用；而Bax可与线粒体上的电压依赖性离子通道相互作用，介导细胞色素C的释放，具有致凋亡作用[11]。P53基因是目前已发现的与人类肿瘤发生相关性最高的抑癌基因，其主要通过激活细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P21的转录，有效的阻止细胞周期进程，抑制细胞增殖以及诱导凋亡[12]。为了了解TDZD-8影响大鼠C6胶质细胞瘤细胞凋亡和细胞周期的机制，本研究检测了Bcl-2、Bax和P53基因的表达情况。研究发现，TDZD-8可剂量依赖性上调Bax和P53基因表达，同时下调Bcl-2表达。

综上所述，GSK-3β抑制剂TDZD-8可剂量依赖性抑制大鼠C6胶质细胞瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞，可能与其对Bcl-2、Bax和P53基因的调控有关。这为TDZD-8及其他GSK-3β抑制剂在肿瘤治疗中提供实验基础。

[1] Gotschel F,Kern C,Lang S,et al. Inhibition of GSK3 differentially modulates NF-kappaB,CREB,AP-1 and beta-catenin signaling in hepatocytes,but fails to promote TNF-alpha-induced apoptosis[J]. Exp Cell Res,2008,314(6): 1351-1366.

[2] Rayasam GV,Tulasi VK,Sodhi R,et al. Glycogen synthase kinase 3: more than a namesake[J]. Br J Pharmacol,2009,156 (6):885-898.

[3] Aguilar-Morante D,Morales-Garcia JA,Sanz-SanCristobal M,et al. Inhibition of glioblastoma growth by the thiadiazolidinone compound TDZD-8[J]. PLoS One,2010,5(11): e13879.

[4] 郭扬,曲国蕃. GSK3β在恶性肿瘤中的作用及研究现状[J]. 现代生物医学进展,2012,22(12):4390-4392.

[5] Cao Q,Lu X,Feng YJ. Glycogen synthase kinase-3beta positively regulates the proliferation of human ovarian cancer cells[J]. Cell Res,2006,16(7): 671-677.

[6] Shakoori A,Ougolkov A,Yu ZW,et al. Deregulated GSK3beta activity in colorectal cancer: its association with tumor cell survival and proliferation[J]. Biochem Biophys Res Commun,2005,334(4): 1365-1373.

[7] Ana Martinez,Mercedes Alonso,Ana Castro,et al.First Non-ATP competitive glycogen synthase kinase 3β(GSK-3β)inhibitors: Thiadiazolidinones(TDZD)as potential drugs for the treatment of Alzheimer’s Disease[J]. J Med Chem,2002,45: 1292-1299.

[8] 刘明明,叶德泳. 糖原合成酶激酶-3β及其抑制剂研究进展[J]. 药学进展,2009,33(4)：145-151.

[9] Collino M,Thiemermann C,Mastrocola R,et al. Treatment with the glycogen synthase kinase-3βinhibitor,TDZD-8,affects transient cerebral ischemia/reperfusion injury in the rat hippocampus[J]. Shock,2008,30: 299-307.

[10] Menschikowski M,Hagelgans A,Tiebel O,et al. Regulation of thrombomodulin expression in prostate cancer cells[J]. Cancer Lett,2012,322(2): 177-184.

[11] Chen Y,Sato M,Fujimura S,et al. Expression of bcl-2,bax,and p53 protein in carcinogenesis of squamous cell lung cancer[J]. Anticancer Res,2003,19 (28): 1351-1356.[12] 张新华,梅开勇,陈广盛.口腔鳞癌中人端粒酶反转录酶、p53 和MIB-1 的表达及其临床意义[J]. 中华生物医学工程杂志，2012，18(2)：112-115.

(本文编辑:王馨)

The growth-inhibitory and apoptosis-inducing effects and underlying mechanism of TDZD-8,a glycogen synthase kinase-3β inhibitor,on rat C6 glioma cells

TangHanxin*,LinXirong,ChenJinjing

(DepartmentofNeurosurgery,ChaoyangDistrictDafengHospital,Shantou,Guangdong515154,China)

*Correspondingauthor:Email:tanghanxin11@126.com

Objective:To investigate the growth-inhibitory and apoptosis-inducing effects and underlying mechanism of TDZD-8,a glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) inhibitor,on rat C6 glioma cells. Methods: MTT method was used to measure the proliferation of rat C6 glioblastoma cells at 6,12,24 and 48h after treated with different concentrations of TDZD-8 (10,20 and 80 μmol/L). Flow cytometry was used to detect the cell apoptosis and cell cycles. The expressions of apoptosis-related genes Bax,Bcl-2 and P53 were also analyzed. Results: TDZD-8 was found to inhibit proliferation of rat C6 glioma cells in a concentration- and time-dependent manner (P<0.05). Flow cytometry showed that TDZD-8 induced cell apoptosis in a concentration-dependent manner,with significant difference among 20,40 and 80 μmol/L dose groups (P<0.05). After treatment with 40 and 80 μmol/L TDZD-8,the percentage of G0/G1 phase C6 cells was increased significantly to 83% and 90%,respectively (P<0.05),while the percentage of S and G2/M phase cells was significantly reduced (P<0.05). At the same time,treatment with 40 and 80 μmol/L TDZD-8 resulted in significantly increased expression of Bax and P53 and reduced expression of Bcl-2 (P<0.05). Conclusion: The GSK-3β inhibitor TDZD-8 may inhibit the C6 cell proliferation in a concentration-dependent manner,and induce apoptosis and cell cycle arrest,which may be related to regulation of Bax,P53 and Bcl-2 expressions.

glycogen synthase kinase 3β; TDZD-8; glioma; cell proliferation; apoptosis; cell cycle

10.3969/j.issn.1008-1836.2016.01.004

2014年汕头市医疗科技计划项目(汕府科[2014]62号-1)

Email:tanghanxin11@126.com

R739.41

A

2095-9664(2016)01-0014-05

2015-12-15)