非肌层浸润性膀胱癌肿瘤标志物及其联合应用的研究进展

徐楠　吴官清　王志华



·综述·

非肌层浸润性膀胱癌肿瘤标志物及其联合应用的研究进展

徐楠吴官清王志华

膀胱癌是目前最常见的尿路上皮肿瘤，其发病率在国内男性泌尿生殖系恶性肿瘤中居首位。膀胱癌中大部分为非肌层浸润性膀胱癌(non muscle-invasive bladder cancer, NMIBC)。现阶段，对于NMIBC的早期诊断及术后随访检测复发的主要手段为液基细胞学检查和膀胱镜检查。膀胱镜检查是诊断膀胱癌的金标准；液基细胞学检查的优点是特异性高、假阳性率低，且属无创性检查，但其敏感性差，假阴性结果较多。因此，寻找特异性和敏感性兼备的肿瘤标志物用于膀胱癌的早期诊断、监测及预后评估，已为越来越多的学者们所关注。本文就NMIBC肿瘤标志物及其联合应用的研究进展做一综述。

一、NMIBC诊断相关分子标志物及联合应用

1.细胞依赖性标志物：①尿脱落细胞内肿瘤相关抗原检查(ImmunoCyt, uCyt+)：uCyt+将免疫荧光实验融入了尿液细胞学检查之中，在显微镜下，观察检测尿液脱落细胞中的被免疫荧光实验染色的癌胚抗原和肿瘤相关黏蛋白。研究显示，uCyt+总体敏感度为50%～100%，特异度为70%～80%，同时假阳性率也很高，造成假阳性率的重要原因是患者自身患有的前列腺增生和膀胱炎症[1]。值得注意的是，uCyt+检测结果的可靠程度受一些外部条件影响，如实验室仪器精密程度、样品处理的时间、染色时间是否充分、实验人员的经验等，这些都限制了这项实验的应用[2]。②多靶点多色荧光原位杂交检查(UroVysion)：UroVysion应用FISH检查液基细胞中的染色体变异情况，主要是3号、7号、17号染色体的变异和染色体9P21的P16肿瘤抑制基因位点的缺失。研究显示，UroVysion的敏感度超过70%，甚至达到80%，UroVysion的特异度也能达到80%，相比液基细胞学，它的总体表现较为优异，主要体现在两者对于Ta期膀胱肿瘤的诊断上[3]。不过，UroVysion有着相对较高的假阳性率，以致它在膀胱癌术后的预后评估上价值较小[3]。但是，又有研究显示，在这些假阳性结果的患者中，有89%的患者会在12个月以内出现阳性检查结果[4]。③微卫星分析：微卫星是一种较短的核苷酸序列，广泛存在于人类基因组之中。9号染色体的异质性缺失是膀胱癌最常见的基因改变之一。膀胱癌患者中，也经常表现出4p、8p、9p、11p和17p染色体异质性的缺失。有研究分析了尿液样本中的17～20种微卫星标志物[5-6]，显示微卫星分析对于诊断NMIBC的敏感度为72%，特异度约为80%。研究还显示，微卫星分析在低分期和低分级的肿瘤检测中较尿液细胞学表现优异[5]。在预后评估方面，微卫星分析在低分级肿瘤的复发评估上有一定优势，其敏感度高达80%，但特异度较差[6]。④端粒酶：端粒酶是一种核蛋白酶，通过合成端粒保证染色体的稳定性。膀胱癌等恶性肿瘤通过上调端粒酶活性使端粒再生避免细胞死亡，端粒酶在90%的癌细胞中高水平表达，尤其是在高分化和高级别的肿瘤中，因此端粒酶可作为一种主要的膀胱癌肿瘤标志物。标准测量端粒酶活性的方法是端粒重复序列扩增技术，其敏感度为75%～100%，特异度为60%～70%[7]。⑤极光激酶A(aurora kinase-A, AURKA)：AURKA通过多种途径参与到有丝分裂中，现在被认为是一个异常的膀胱癌标志物。它在肿瘤细胞中过度表达，且表达水平和细胞的异型性密切相关。一项实验研究，通过FISH实验检查AURKA基因，AURKA的敏感度为85%，特异度为96%[8]。

2.可溶性标志物：①膀胱肿瘤抗原(baldder cancer antigen, BTA)：BTA stat和BTA trak检测尿液中补体因子H和H相关蛋白。人体补体因子H相关蛋白介入补体之间作用链，使得肿瘤细胞躲避宿主的免疫攻击从而获得生长优势。这两种实验都被美国FDA批准，但并不作为主要的诊断手段，而是作为膀胱镜的辅助检测手段[9]。一系列研究显示，BTA stat总体的敏感度为57%～83%，特异度为60%～92%[9-10]。研究证明，BTA stat实验在检测复发时的敏感度很低，而检测初发肿瘤时的敏感度较高，这可能和复发肿瘤通常直径较小有关，而BTA trak在检测高分期、分级的患者时，敏感性和特异性反而会升高[10]。②核基质蛋白(NMP22)：NMP蛋白家族是细胞核的结构蛋白的构成成分，支撑细胞核形状的维持。NMP22相对于家族其他成员，在膀胱癌组织中的表达水平较高，比正常尿路上皮组织的表达水平高25倍以上。NMP22的敏感度为47%～100%，特异度为60%～90%[11]。NMP22的劣势主要在于它的特异性较低，因为NMP22蛋白主要从凋亡或死亡的细胞中释放，而很多别的疾病也会造成假阳性结果，其原因主要有膀胱的炎症、尿路感染性疾病、泌尿系结石[12]。③特异性核基质蛋白(BLCA-4)：BLCA-4和BLAC-1是膀胱癌中经常出现的核转录因子。BLCA-1和BLCA-4都不在正常组织中表达，只在恶性细胞中表达，而BLCA-4在恶性细胞和癌旁组织中表达。临床上通过ELISA检测尿液中BLCA-4的含量，敏感度为89%～96%，特异度为100%[13]。研究表明，BLCA-1与之类似，敏感度达到80%，特异度为87%[14]。肿瘤的等级并不影响它们的表达。不过，19%的脊柱损伤患者能检测到BLCA-4水平，这说明它们的表达也不一定与肿瘤相关[15]。④透明质酸-透明质酸酶：透明质酸(hyaluronicacid, HA)在肿瘤组织中表达较高，并且可以分泌至膀胱中，使尿液中的HA含量上升。透明质酸酶(hyaluronidase, HAase)是一种蛋白酶，它对于底物的选择有着高度的特异性，特异性水解HA。临床上，可以通过尿液中HA和HAase含量的检测，来判断膀胱癌的发生。研究显示，HA-HAase检测有着相对较高的敏感度(90%)、特异度(80%)和精确度(85%)[16]。⑤尿膀胱癌抗原(urinary bladder cancer antigen, UBC)：UBC-RAPID和UBC-ELISA都是用免疫相关方法检测尿液中的细胞角蛋白(CK)8和CK18蛋白片段。CK是一种胞内蛋白，只有细胞凋亡或死亡后在尿液中才能检测到。UBC-RAPID是一种快速床边实验，检测两种CK与抗体结合的复合物。研究表明，UBC-RAPID的敏感度为59%，特异度为86%[17]。不过这项技术仍需临床进一步研究。

3.联合应用：尿液中单一标志物检测很难满足早期膀胱癌诊断的要求。近年来，有关膀胱癌多标志物联合诊断的研究日益增多。李红全等[18]通过对196例患者进行液基细胞学检查，同时对尿液中NMP22、BTA进行检测，结果发现三者联合检测的诊断敏感度明显高于三者单独检测。一项多研究的Meta分析显示，对于几乎所有类型的膀胱癌，尿液细胞学检查的敏感度都能达到44%左右，但是另外一些更新的技术在敏感度上已经超越了作为金标准的尿液细胞学检查，如ImmunoCyt(敏感度84%；95%CI77%～91%)、UroVysion(76%; 95%CI65%～84%)、NMP22(68%; 95%CI62%～74%)[19]。而且，Marcus等[20]用一项包含106例患者的队列研究观察ImmunoCyt、UroVysion、FISH等几项技术的联合应用，以求达到更加准确的检测结果，研究发现联合应用Cytology、FISH(UroVysion)、ImmunoCyt和NMP22(ELISA)后，检查的敏感度达到了90%以上。

二、预后相关分子标志物及联合应用

目前以临床病理因素为基础的EORTC评分系统和CUETO评分系统被西方国家用于NMIBC复发和进展的评估，但其在反映NMIBC的异质性、复发和进展[21]以及对高风险患者鉴别方面[22]存在不足。寻找有效的分子标志物来早期、精确预测术后复发及进展是当前NMIBC面临的重要挑战。

1.与NMIBC复发相关的分子标志物：①P53：p53基因是细胞周期中非常重要的抑癌基因，参与细胞分化与增殖的调控，调节DNA修复的作用，可抑制正常细胞向癌细胞转化，也是预测膀胱癌预后的最常用的分子标志物之一。一项400例膀胱癌患者标本的组织芯片研究表明，突变型P53蛋白在普通尿路上皮组织、NMIBC、CIS、MIBC和淋巴转移结节中的表达量逐级递增[23]，这说明了P53与膀胱癌的恶性程度呈正相关。另一项研究，通过对比P53高表达组(大于60%)和低表达组(小于60%)在TURB术后复发率，发现高表达组的5年无复发的生存率明显低于低表达组，说明突变型P53表达和复发率呈正相关，表达越高复发率也就越高[24]。②成纤维细胞生长因子受体3(fibroblast growth factor receptor 3, FGFR3)：FGFR3是从4号染色体中分离得到的，与突变基因的表达和肿瘤的临床病理密切相关，在分级、分期低的早期膀胱癌中呈现高表达，相反，在高分期浸润深的晚期膀胱癌中呈现低表达[25]。Burger等[26]通过对221例患者的肿瘤标本检测FGFR3的突变，并进行复发和进展的对比，以预测高分级和低分级NMIBC的复发和进展，发现FGFR3和复发确实密切相关，可以作为检测复发的肿瘤标志用于研究和临床应用。③DNA甲基化：DNA甲基化是一种对基因的表观修饰。多个基因的甲基化都与膀胱癌的发生、发展及预后相关，Kim等[27]经过研究发现，RUNX3基因有甲基化而失活的现象，而在正常的膀胱黏膜上皮并没有明显发现它的甲基化现象，这提示了RUNX3基因的甲基化水平与膀胱癌尤其是进展性膀胱癌预后有着正相关。另外，Qi等[28]通过MSP法检测膀胱原位癌患者血清中的DAPK基因甲基化水平，其中有65%的标本呈现出DAPK基因的异常甲基化现象。同时，这种DAPK异常甲基化在G1期患者中比例为71.4%，在G2期的患者为55%，提示DARK基因的高甲基化与病理分级有关。④Ki-67：Ki-67是一种非组蛋白核蛋白，表达于增殖细胞的G1、S、G2和M期，在G2期表达最高，但在G0期无表达，其高表达是细胞增殖活跃的重要标志。Ki-67的表达对肿瘤的转移及预后有影响。Ogata等[29]发现Ki-67的表达和膀胱癌的复发率有着非常重要的联系。Nagata等[30]发现 Ki-67的高活性是造成膀胱癌TURB术后2年内高复发率的关键因素。

2.与NMIBC进展相关的分子标志物：①miRNAs：miRNAs是18～24个核苷酸长短的的非编码RNA，通过内源性结合抑制或阻断基因表达功能。miRNAs作为肿瘤的抑制因子或致癌因子出现在膀胱癌中。通常在膀胱癌中能观察到下调的miRNAs有miR-145、miR-143和miR-125b，所以它们可能是肿瘤的抑制因子，而出现上调的有miR-183、miR-96和miR-17-5p，所以它们可能是致癌因子。抑制因子中，最常见的是miR-145和miR-29c[31]。Rosenberg等[32]通过检测108例NMIBC患者的膀胱癌标本，发现在有进展发生的患者中，50%都伴随着miR-29c的表达下降，而无进展发生的患者中，90%的患者伴有miR-29c的高表达。②CK20：CK20是CK家族中的一员，它主要在正常尿路上皮的表层细胞和中层细胞中表达。在膀胱癌中，尤其是在NMIBC中，其异常表达被认为是不良预后的标志之一。有研究显示，CK20和Ki-67的联合表达是影响膀胱癌TURB术后无进展生存期时间长短的重要因素[33]。③Heme oxygenase-1：Collinson等[34]发现Heme oxygenase-1在复发和侵袭的患者组织中含量非常高，这提示Heme oxygenase-1表达不仅和细胞增殖有关，而且还与NMIBC的预后和侵袭性有很大关系。④P21：P21在细胞的分化、生长和增殖中起重要作用，是一种能与鸟苷酸结合并具有GTP酶活性的蛋白，参与信号传递尤其是细胞膜的信号传递。P21的过量表达与膀胱癌的发生和预后关系十分密切。Agnantis等[35]通过检测膀胱癌组织标本中P21蛋白的含量，发现膀胱癌组织的P21表达明显高于癌旁组织及正常的尿路上皮组织。刘海南等[36]也做了类似研究，结果显示，P21在膀胱癌组织的表达率约为60%。不仅如此，它的表达还与TNM分期和WHO分级相关，较高分期、分级组织中表达率高于分期、分级较低的组织。

3.联合应用：①Molecular grade(mG)：mG是在FGFR3突变位点和增值信号Ki-67的表达的层面上提出来的。它一经提出，即被认为是预测膀胱癌进展的一个非常有效的方法。一项对比WHO病理分级和mG效果的研究发现，对于预测NMIBC的预后，mG是比病理分级更加可信、可靠的手段[37]。不止FGFR3和Ki-67，有的研究用新的分子标志来构建mG模型。Shariat等[38]的研究检测了NMIBC的3个独立预后因子对于膀胱癌复发和进展的预测意义，单独运用时，P53的HR为3.66(P=0.033)，P27的HR为3.76(P=0.048)，Ki-67的HR为0.021(P=0.021)，但是联合检测更有意义(P<0.001)，联合检测预测膀胱癌复发的准确性为80%。另有研究利用另外的一些肿瘤标志的异常表达联合分析，也发现联合检测有着提升预测肿瘤复发准确性的作用[39]。②分子标志和临床病理的联合：Shariat等[23]的研究表明，p53、pRb和p21基因均为NMIBC进展的独立预后因素。将肿瘤分级、分期与p53、pRb、p21、p27生物标志物联合分析时，p53和p27是唯一的独立预测疾病复发和进展的标志物。当控制肿瘤的分级和分期对NMIBC的影响后，随着生物标志物数量的增加，膀胱癌复发(P=0.011)及进展(P=0.005)的风险也增加。Ding等[40]更进一步将EORTC评价表中临床病理因素对预后的预测能力和Ki-67的表达水平联系起来，共同预测NMIBC的预后。

三、结语

虽然膀胱癌相关的肿瘤标志物正在不断地涌现，但对于诊断膀胱癌和预测预后，还是不能替代膀胱镜检查。新近研究的标志物尚需一些大样本实验来进一步验证其临床应用价值。尤其是标志物的联合应用是否可以提高对膀胱癌早期诊断的敏感性和特异性，以实现更好地早期诊断膀胱癌，仍然需要大量的临床随机对照研究来证实。

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(本文编辑：熊钰芬)

430030 武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科

王志华，E-mail:zhwang_hust@hotmail.com

10.3870/j.issn.1674-4624.2016.03.017

2016-03-31)