维药毛菊苣水提取物抗炎作用的实验研究

2016-10-13杨巧丽马雪萍司丽君史玉柱新疆维吾尔自治区药物研究所新疆乌鲁木齐830004

中国医药导报 2016年24期

杨巧丽　王　雪　马雪萍　刘　燕　司丽君　史玉柱新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆乌鲁木齐830004

维药毛菊苣水提取物抗炎作用的实验研究

杨巧丽王雪马雪萍刘燕司丽君史玉柱
新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆乌鲁木齐830004

目的探讨维吾尔族习用药材毛菊苣水提取物（MS）的抗炎作用。方法体外采用脂多糖（LPS）诱导小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞，建立炎症模型。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测MS的细胞毒性作用，采用Griss法检测细胞上清中NO的生成量，酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞上清中白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-10（IL-10）的水平；在体实验采用冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进模型，观察MS的体内抗炎作用。结果体外实验，与空白对照组比较，MS 250μg/mL以下浓度对RAW264.7细胞生长无影响。MS 15.625、31.25、62.5、125、250μg/mL浓度均可明显抑制LPS诱导的RAW264.7细胞上清中NO和IL-10的生成（P＜0.01），此外，250μg/mL剂量组可显著抑制IL-1β的分泌（P＜0.01），且随着MS浓度的升高，对TNF-α分泌的抑制作用逐渐增强；在体实验，与模型组比较，MS 130、260mg/kg剂量组对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进均有显著的抑制作用（P＜0.01），抑制率分别达到49%和57%。结论MS具有显著的抗炎活性。

毛菊苣；水提取物；抗炎作用；RAW 264.7细胞；白细胞介素-1β：白细胞介素-10；肿瘤坏死因子-α

［Avsteact］Ov jective To investigate the anti-inflammatory effects of CichoTium glandulosum Boiss.et Huet aqueous extracts（MS）.M ethods In vitTo，lipopolysaccharide was used to induce RAW264.7 cells to build model of inflammation. The effect of MSon cell toxic was detected bymethyl thiazolyl tetrazolium assay（MTT）.The NO generation in cell supernatantwas detected by Grissmethod，and the levels of interleukin-1β（IL-1β），tumor necrosis factor-α（TNF-α）and interleukin 10（IL-10）in cell supernatantwere detected by Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.In vivo，themodels of the increase of capillary permeability in mice induced by acetic acid were used to evaluate the anti-inflammatory effect of MS.Results In vitTo，compared with the control group，MS（≤250μg/mL）had no influence on the proliferation of RAW264.7 cells.MS 15.625，31.25，62.5，125，250μg/mL significantly decreased the levels of NO and IL-10（P＜0.01）.Meanwhile，250μg/mLMSsignificantly decreased the levels of IL-1β（P＜0.01），and with the increase of the concentration of MS，the inhibition on TNF-αsecretion gradually strengthened.In vivo，compared with themodel group，130，260 mg/kg MS significantly inhibited the increase of abdominal cavity capillary permeability in mice caused by acetic acid（P＜0.01），the inhibition rate was 49%and 57%respectively.Conclusion MShas significantanti-inflammatory effects.

［Key woeds］CichoTium glandulosum Boiss.et Huet；Aqueous extracts；Anti-inflammatory effect；RAW264.7 cells；Interleukin-1β；Interleukin-10；Tumor necrosis factor-α

维吾尔族习用药材菊苣（CichoTii HeTba/CichoTii Radix）为菊科植物毛菊苣（CichoTium glandulosum Boiss.et Huet）或菊苣（CichoTium intybus L.）的干燥地上部分或根，2015年版《中国药典》收载品种［1］，是清热卡森颗粒（国药准字Z65020172）、护肝布祖热颗粒（国药准字Z65020168）、复方木尼孜其颗粒（国药准字Z65020166）、炎消迪娜儿糖浆（国药准字Z65020183）的主要原料药材［2-3］。维吾尔医习用毛菊苣水提取物（MS）治疗肝炎、胆囊炎等炎症性疾病，以上4个方剂的现代药理学研究也已证实该方面的功效［4-8］。临床研究表明，肝脏炎症坏死及其所致的肝纤维化［9］是肝炎疾病进展的主要病理学基础。因此，在对病因治疗的基础上有效控制肝组织炎症，有可能减少肝细胞破坏和延缓肝纤维化的发展［10-11］。故本课题在研究MS保肝和体外抗乙型肝炎作用的同时，拟开展其抗炎作用的研究，查阅相关文献抗炎作用的研究尚属空白，故本研究采用MS处理巨噬细胞系RAW264.7细胞，建立炎症模型，并结合其对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进模型的研究，旨在初步探讨MS的抗炎作用，为毛菊苣的临床开发应用提供理论线索。

1　材料与方法

1.1药品与试剂

毛菊苣全草，采自新疆吉木萨尔县泉子街镇十八户村，药材经新疆药物研究所维药室何江副研究员鉴定，MS样品为新疆药物研究所制备，岀膏率为10.7%；地塞米松（Dexamethasone，DEX，浙江仙琚制药股份有限公司生产，批号：140672）；脂多糖（LPS）（sigma公司，批号：L2880）；冰醋酸（天津市福晨化学试剂厂，批号：20130112）；伊文思蓝（上海化学试剂采购供应站分装厂出品，批号：20120917）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-10酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（北京四正柏生物科技有限公司，批号：20140722）。

1.2动物和细胞株

SPF级6～8周龄，昆明种小鼠，雌雄兼用，体重18～22 g；由新疆实验动物研究中心提供，生产许可证号：SCXK（新）2011-0001。动物适应性喂养3 d，适应期12 h/12 h明暗交替，并观察动物毛发、排泄物、活动及体重生长情况，动物正常采食、饮食，并最终选取合格动物进入实验。小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7（中国医学科学：协和药物研究所筛选中心惠赠）。

1.3仪器

Spectramax M2型微孔板监测系统，Molecular Devices；SP-752型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；SW-CT-2FD型苏净安泰超净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；XDS-1B倒置显微镜，重庆光学仪器厂。

1.4方法

1.4.1MS对LPS诱导RAW264.7细胞NO的生成和TNF-α、IL-1β、IL-10蛋白表达量的影响

1.4.1.1RAW264.7细胞培养的培养与传代小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞加入含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和链霉素的RPMI 1640培养基，置于含5%CO2、37℃培养箱中培养。细胞生长至70%～80%融合后进行传代，3～4 d左右传代1次。

1.4.1.2MTT法检测不同浓度MS对RAW264.7细胞生长的影响取对数生长期的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞，依据文献方法［12-15］，测定终浓度7500、3750、1875、937.5、468.75、234.4μg/mL的MS对RAW264.7细胞生长的影响，并计算抑制率。抑制率=（A空白对照组-A给药组）/A空白对照组×100%。

1.4.1.3MS对细胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-10表达的影响［16-18］于96孔细胞培养板中每孔加入100μL（2× 105个细胞/mL）细胞悬液，将培养板置于CO2培养箱中培养12 h，每孔换成无血清的180μL RPMI 1640培养液。先于每孔中加入DEX和5个不同浓度（“1.4.1.2”确定的无毒浓度）的MS培养液10μL置于37℃、5%CO2培养箱中作用1 h，每个浓度设3个平行孔，另设正常对照孔（control组）、模型组（LPS组）。1 h后细胞对照孔和模型组分别加入20μL/孔和10μL/孔无血清的180μL RPMI 1640培养液，其余各组每孔分别加入终浓度1μg/mL的LPS 10μL补足体系200μL/孔，混匀后置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养24 h，吸取培养上清液，Griss法测定NO浓度，ELISA法测定TNF-α、IL-1β、IL-10的浓度。

1.4.2对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进的影响［19］

将48只昆明种小鼠，依性别、体质量均衡随机分为模型组、DEX 9.7 mg/kg组和MS 130、260 mg/kg剂量组，共4组，每组12只，灌胃给药1次/d，连续4 d，末次给药后1 h，各鼠均尾静脉注射0.5%伊文思蓝生理盐水溶液0.1 mL/10 g，随即腹腔注射0.8%冰醋酸0.2mL/只，20min后脱颈椎处死小鼠，剪开腹部皮肤肌肉，用6mL生理盐水分数次洗涤腹腔，吸出洗涤液，3000 r/min（离心半径：6 cm）离心5 min，取上清液于590 nm测定吸光度值，并进行组间t检验。抑制率（%）=（A590nm模型组-A590nm给药组）/A590nm模型组×100%。

1.5统计学方法

运用SPSS 13.0统计软件进行处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1MTT法检测不同浓度MS对RAW 264.7细胞生长的影响

空白对照组和MS 234.4、468.75、937.5、1875、3750、7500μg/mL剂量组测定的吸光度值见表1。

表1　MS对RAW 264.7细胞生长的影响

2.2MS对细胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-10表达的影响

LPS刺激RAW264.7细胞24 h后，与control组比较，LPS组中NO、IL-1β、IL-10、TNF-α蛋白水平均显著升高。与LPS组比较，MS（15.625、31.25、62.5、125、250μg/mL）上清中NO的含量和IL-10的分泌量均显著降低（P＜0.01），TNF-α的蛋白表达量随MS浓度的增高逐渐降低，此外250μg/mLMS对IL-1β蛋白水平有极显著的抑制作用（P＜0.01），并且MS细胞上清中NO的分泌量和TNF-α、IL-1β、IL-10的表达量均呈现一定的剂量依赖性。见图1～3。

图1　MS对LPS诱导RAW 264.7细胞上清中NO表达的影响（x±s，n=3）

图2　MS对LPS诱导RAW 264.7细胞上清中IL-1茁尧IL-10表达的影响（x±s，n=3）

图3　MS对LPS诱导RAW 264.7细胞上清中TNF-琢表达的影响（x±s，n=3）

2.3对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进的影响

各给药组腹腔洗涤液较模型组为浅，由表2可见，与模型组比较，DEX 9.7mg/kg组，MS 130、260mg/kg剂量组对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进均有显著的抑制作用（P＜0.01），抑制率分别为51%、49%、57%，表明MS能抑制H+所致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进。

表2　MS对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进的影响（x±s，n=12）

3　讨论

炎症（inflammation）是人类疾病中最常见而复杂的病理过程，可以发生于机体的任何部位和任何组织，是机体清除刺激因素、对局部组织损伤进行修复的过程。大部分患者存在不同程度的炎性反应，会进一步加重疾病的发展，甚至诱发严重的肿瘤疾病。故治疗与控制患者的炎性反应，对改善疾病的治疗效果及预后具有十分重要的意义［20］。

维吾尔医将MS用于临床肝炎的治疗，现代科学研究表明，肝脏炎症坏死是导致病毒蔓延与迅速发展的关键病理学基础，在全面找出致病因子的基础上采取对症治疗才能对肝组织炎症进行有效的控制，进一步延缓肝纤维化及减少肝细胞损伤的发展［21］。此外在炎性反应过程中的两类炎症介质：促炎反应介质（如肿瘤坏死因子、IL-1等）和抗炎反应介质（如IL-10、IL-4、IL-5等），它们以自分泌、旁分泌、内分泌等作用于局部和全身，以正负反馈方式相互调控，炎性反应的转归将取决于这两大类介质的平衡，任何一方的过度优势均可造成炎症失控、内环境稳定的破坏。NO在炎症级联反应中起到关键的调节作用，尤其在炎性反应的发生和信号传导方面［22］。NO具有促炎性细胞因子如TNF-α、IL-1产生的作用，NO介导和促进炎症的有力证据是在多种炎症性或免疫性动物模型中，在NO浓度显著升高过程中，抑制NO合成可使典型的炎症症状得到明显改善［23］。探讨毛苣菊水提取物的抗炎作用将有助于探明其保肝的作用机制。

在本研究中，在1μg/mL LPS的刺激下，RAW 264.7细胞分泌了炎症介质和细胞因子：NO、TNF-α、IL-1β、IL-10，而MS抑制了NO的分泌，而NO的减少可能进一步减少了LPS介导的巨噬细胞释放的炎症因子类介质TNF-α、IL-1β的分泌量，从而起到抑制炎症的作用。但IL-10在LPS的刺激下增高后，并未随着药物浓度的增高而得以抑制，从而发挥抗炎反应介质的作用，相反它随着药物浓度的增高而增高，该疑问期望在今后的实验研究中寻找到答案。

为进一步考察MS的抗炎活性，本研究选择了冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进的急性炎症模型，研究结果表明：MS 130、260 mg/kg剂量组对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进有显著的抑制作用（P＜0.01），抑制率分别为49%、57%，表明其能抑制H+所致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进。体内外实验结果表明MS具有一定的抗炎活性。

本研究是在药典记载MS的有效剂量下开展的其抗炎作用的研究，结果显示MS具有一定的抗炎活性，但它在疾病模型中是否还能发挥其抗炎活性及如何发挥将是笔者下一步研究的重点。本课题组将结合本研究结果进一步开展其保肝、抗炎免疫调节作用的实验研究，同时开展其保肝作用物质的基础研究。

［1］国家药典委员会.中国药典［S］.北京：中国医药科技出版社，2015：310.

［2］国家药典委员会.卫生部药品标准-维吾尔药分册［M］.乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1999：136，164，159，189.［3］艾尔肯·米吉提帕尔哈提·吐尔逊古丽努尔·塔力甫.不同种植基地菊苣药材的质量对比研究［J］.中国民族医药杂志，2011，17（9）：82-85.

［4］秦冬梅，胡利萍，聂亚茹.毛菊苣萃取物对肝纤维化大鼠肝组织4种不同蛋白表达的影响［J］.中华肝脏病杂志，2013，21（10）：776-777.

［5］庞市宾，吴发宝，刘晓燕.毛菊苣提取物对四氯化碳诱导大鼠肝纤维化的防治作用［J］.药学评价研究，2013，36（6）：418-421.

［6］秦冬梅，文志萍，王新春.维药毛菊苣萃取物对肝纤维化大鼠的保护作用［J］.中国医：药学杂志，2013，33（18）：1480-1483.

［7］杨飞，罗玉琴，薛桂蓬，等.为要毛聚聚根-种子不同比例配伍的90%乙醇提取物对小鼠急性肝损伤的保护作用及其机制［J］.中国医：药学杂志，2015，35（15）：1352-1356.

［8］秦冬梅，姚新城，薛梅，等.毛菊苣萃取物对大鼠肝纤维化细胞凋亡的影响［J］.中国医：药学杂志，2015，35（7）：579-583.

［9］陈奇.中药药效研究思路与方法［M］.北京：人民卫生出版社，2005：502.

［10］王宇明.抗炎保肝药物的作用机制及地位［J］.中华肝脏病杂志，2011，19（1）：76-77.

［11］凡杭，陈剑，梁呈元，等.菊苣化学成分及其药理作用研究进展［J］.中草药，2016，47（4）：680-686.

［12］刘静，刘瑛，李宾，等.槐定碱抑制脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症因子分泌及机制［J］.细胞与分子免疫学杂志，2015，31（5）：585-589.

［13］孟迂，邹秦文，自金叶，等.人工麝香水提物对脂多糖诱导RAW264.7细胞炎性介质表达的影响［J］.中国医学科学：学报，2014，36（6）：583-586.

［14］Yang Y，Yu T，Jang HJ，et al.In vitro and in vivo antiinflammatory activities of Polygonum hydropiper methanolextract［J］.JEthnopharmacol，2012，139（2）：616-625.

［15］Yu T，Lee S，YangWS，et al.The ability of an ethanol extractof Cinnamomum cassia to inhibit Src and spleen tyrosine kinase activity contributes to its anti-inflammatory action［J］.JEthnopharmacol，2012，139（2）：566-573.

［16］黄丽华，王纯洁，敖日格勒，等.蒙药特润舒都乐浸膏对脂多糖刺激RAW264.7细胞分泌炎症因子的影响［J］.细胞与分子免疫学杂志，2013，29（4）：387-389.

［17］汪娟，蒋维，王毅.降香中黄酮类化合物对脂多糖诱导的RAW264.7细胞抗炎作用研究［J］.细胞与分子免疫学杂志，2013，29（7）：681-684.

［18］李强，陈学智，谢志军.祛浊通痹方抗炎镇痛作用及对脂多糖诱导Raw264.7细胞的抗炎活性［J］.中华中医药杂志，2015，30（10）：3758-3760.

［19］陈奇.中药药理研究方法学［M］.北京：人民卫生出版社，2006：300-301.

［20］黄滨，雷小勇.中药抗炎作用发挥途径及作用机制研究进展［J］.临床合理用药，2015，8（110）：177-179.

［21］李萍.抗炎保肝治疗在肝病临床中的应用与地位［J］.临床医药文献杂志，2015，2（15）：3141-3142.

［22］段金成，丁志峰，和红兵.炎症反应介质对炎症影响机制的探讨［J］.昆明医学：学报，2009（3B）：261-263.

［23］周武庆.一氧化氮在炎症和免疫调节中的作用［J］.国外医学：皮肤性病学分册，1999，25（4）：233-235.

Expeeimental study on the anti-inflammatoey effect of Cichorium glandulosum Boiss.et Huet aqueous exteacts

YANG Qiaoli WANG Xue MA Xueping LIU Yan SILijun SHIYuzhu

Xinjiang Institute of Materia Medica，Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830004，China

R285.5