两种非整合载体重编程人脐带血CD 34+细胞形成诱导多能干细胞的研究

张权娥　史文婷　陶　红　何正梅　丁邦和　王春玲　于　亮　李玉峰南京医科大学附属淮安第一医：血液科，江苏淮安223300

两种非整合载体重编程人脐带血CD 34+细胞形成诱导多能干细胞的研究

张权娥史文婷陶红何正梅丁邦和王春玲于亮李玉峰
南京医科大学附属淮安第一医：血液科，江苏淮安223300

目的探索两种非整合载体重编程人脐血来源的CD34+细胞形成诱导性多能干细胞（iPSCs）的方法。方法利用细胞核转染仪分别将两组非整合质粒转入短暂培养后的脐带血CD34+细胞中，使其进行重编程形成iPSCs，14 d后两种方法均可观察到2×106个脐带血CD34+细胞中约有900个类似ES细胞特征的克隆出现，并对产生的iPSCs进行体内外多能性鉴定及细胞核型检测。结果两种方法重编程效率基本相同，重编程形成的hiPSCs多能性基因OCT4、SOX2、NANOG的表达量与hES细胞系H1比较接近（P＞0.05），而与CD34+细胞差别较大（P＜0.05），且具有体内分化成三胚层的全能性。结论两种非整合质粒重编程人脐带血来源的CD34+细胞形成iPSCs的方法，效率基本相同，均无外源基因插入，为建立相对安全的iPSCs提供了有效途径，为临床科研、药物筛选和再生医学研究等提供了较好的方法。

诱导多潜能干细胞；重编程；脐带血CD34+细胞；非整合型质粒

［Avsteact］Ov jective To establish two episomal vector reprogramming methods to reprogram iPSCs from human cord blood（CB）CD34+cells.M ethods Two sets of non-integrating plasmidswere respectively transported into two groups of short-term cultured CB CD34+cells by using transfector nucles，to reprogram iPSCs from CB CD34+cells.Within 14 days of transfection by two sets of non-integrating plasmids，up to 900 iPSC-like colonies per 2 million transfected CB CD34+cells were generated.And the pluripotency and karyotypes of iPSCs were tested in vitTo.Results The reprogramming efficiency of twomethods was basically the same.The pluripotency genes OCT4，SOX2 and NANOG expression levels of the hiPSCswere close to the hES cell line H1 cells（P＞0.05），but different from the CD34+cells（P＜0.05）.Furthermore，the hiPSCs formed teratomas with three embryonic germ layers.Conclusion Two efficient reprogrammingmethods have basically the same efficiency，and no vector integration is found in iPSCs.It is concluded that the non-integrating plasmid system to generate human iPSCs from CB CD34+cells is reliable and can provide new ways for clinical research，drug screening and regenerativemedicine research.

［Key woeds］Induced pluripotent stem cells；Reprogramming；Cord blood CD34+cells；Non-integrating plasmid

诱导性多潜能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）是指将特定的转录因子导入成体细胞，重编程形成的形态和功能上类似于胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）的一类细胞。自从2006年日本东京大学的Takahashi等［1］第一次发现iPS细胞以来，经过各国研究者努力探索，iPS诱导技术有了突飞猛进的发展。近年来重编程iPSCs的方法不断优化，如纯化的蛋白、mRNAs和非整合型质粒等［2-10］。然而，使用蛋白和mRNAs都需要多次重编程靶细胞，效率较低。人们使用非整合质粒成功的重编程人神经祖细胞和神经成纤维细胞，形成了非整合型iPS细胞系［4-5］。Chou等［8］报道了使用一种游离型载体EBNA1/OriP高效重编程人脐带血细胞和外周血细胞形成iPSCs，避免了基因整合的危险。Meng等［11］也利用改进的游离型载体高效重编程脐带血CD34+细胞形成了无基因整合的iPSCs。为了使人体细胞的iPSCs可以分化成所需的细胞类型，用于临床治疗、体外重建疾病模型、药物筛选，利用一种基因非整合型和无病毒插入型诱导技术重编程人成体细胞形成iPSCs是更有应用价值的方法。本研究利用两种游离型载体，并携带不同的质粒组合，即pEB-C5、pEB-Tg和pEV SFFV-OS、pEV SFFV-MK、pEV SFFV-B分别将人脐带血来源的CD34+细胞重编程形成了质粒非整合型hiPSCs，并对其多能性进行鉴定。两种方法效率相似，均无外源基因插入，具有高效性和安全性，进一步推动了hiPSCs临床应用的进程。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

人脐带血（天津市中心妇产科医：提供，患者签署知情同意书）来源的CD34+细胞；小鼠成纤维细胞（MEF）；H1细胞系（天津血液病研究所保存）；pEBC5（表达OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC和LIN28）和pEB-Tg（SV40 Large T antigen）（Addgene公司）；pEV SFFV-OS（OCT4-2a-SOX2），pEV SFFV-MK（MYC-2a-KLF4）和pEV SFFV-B（BCL-XL）（天津血液病研究所保存）；Human CD34+cell nucleofection kit（Lonza公司）；Anti-TRA-1-60、Anti-SSEA4、Anti-OCT4、Anti-Nanog和Accutase（Stemgent公司产品）；引物对（Millipore公司）：hOct4上游引物5＇-ATTCAGCCAAACGACCATCT-3＇，下游引物5＇-GCTTCCTCCACCCACTTCT-3＇；hSox2上游引物5＇-CACACTGCCCCTCTCACACA-3＇，hSox2下游引物5＇-CCCTCCCATTTCCCTCGTTT-3＇；NANOG上游引物5＇-GCC GAAGAATAGCAATGGTGTG-3＇，NANOG下游引物5＇-GGAAGAGTAGAGGCTGGGGTAG-3；hGAPDH上游引物5＇-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3＇，hGAPDH下游引物5＇-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3＇。

1.2方法

1.2.1人脐带血CD34+细胞的分离培养利用Ficoll密度梯度离心法分离取得人脐带血单个核细胞（human cord blood mononuclear cells，hCB-MNCs），然后避光操作，每108个细胞先加入100μL Fc-R阻断剂，再加入100μL CD34+Microbeads，充分混匀后4℃避光孵育30min，再利用MACS磁珠分选得到人脐带血CD34+细胞。获得人脐带血CD34+细胞培养在6孔板，使用人CD34+细胞培养基进行培养。

1.2.2非整合质粒转染重编程过程人脐带血CD34+细胞培养9 d，使用Amaxa细胞核转染仪行细胞核转染（称为转染第0天）。两组不同的方法分别进行转染。第1种方法：质粒包含pEB-C5和pEB-Tg，比例为8μg pEB-C5+2μg pEB-Tg，质粒转染程序为T-016。第2种方法：pEV SFFV-OS、pEV SFFV-MK和pEV SFFV-B，比例为10μg OS+5μg MK+5μg B，质粒转染程序为U-008。将转染后的细胞（2×106细胞）种到12孔板的1个孔中培养，24 h后转移到预先铺有MEF的6孔板，加入hES培养基和MEF培养基每孔各1mL，封口膜封闭平板进行离心，1000 r/min 25℃30 min。继续培养，用hES培养基隔天换液，第9天时更换条件培养基（MEF-derived conditioned medium，MEF CM），电转后第3天开始加NaB（0.25 mmol/L），直到克隆形成。转染第14天用TRA-1-60活染鉴定完全重编程的细胞并挑取克隆进行传代培养（图1）。

图1　非整合质粒转染重编程脐带血CD34+的流程图

1.2.3i PSCs初步鉴定并传代用TRA-1-60鼠IgM抗体染色，初步鉴定重编程的克隆，TRA-1-60抗体（1∶300）和Alexa555标记的抗小鼠IgM二抗（1∶500）稀释于ESC培养基中，然后加入重编程的细胞中，0.5 mL/孔，37°C孵育1 h，PBS洗1遍，加入新鲜的ESC培养基或CM。倒置荧光显微镜下观察TRA-1-60+克隆形成情况，计数克隆总数及TRA-1-60+克隆数，挑取阳性的克隆传代培养扩增，传至8～10代细胞系基本稳定。

1.2.4免疫荧光染色检测i PSCs多能性基因表达两组质粒诱导形成的CB-CD34+iPSCs分别传代扩增，取传代至第5代（P5）的一部分细胞传到24孔板中，当iPS细胞克隆长到适当大小时，使用4%多聚甲醛固定细胞15 min，然后0.1%Triton X-100透膜10 min，PBS洗3遍，再加入山羊血清工作液室温封闭15min。取稀释好的抗体anti-TRA-1-60（1∶300）、anti-SSEA-4（1∶100）、anti-NANOG（1∶100）、anti-OCT4（1∶100），分别加入相应的孔中，100μL/孔，室温避光孵育2 h，然后PBS洗3遍，每孔加入相应的二抗Alexa FLuor 488标记的羊抗兔IgG或Alexa555标记的羊抗鼠IgM/IgG（1∶500），室温避光孵育1 h，PBS洗3遍，再加入DAPI染细胞核5min，PBS洗3遍，倒置荧光显微镜下观察胚胎干细胞4种多能性标志基因TRA-1-60、SSEA-4、NANOG、OCT4表达。

1.2.5Rea l-t ime PCR检测全能性基因表达6孔板中iPSCs用稀释好的accutase进行消化，除去支持细胞，加入PBS终止消化，吸出废液。加入hESM，将iPSCs克隆刮下放入离心管，1000 r/min离心5 min，弃上清，提取细胞RNA，反转录成cDNA。取重编程CB-CD34+形成的iPSCs、H1细胞（即hES细胞系，阳性对照）、CB-CD34+细胞（阴性对照）的cDNA进行Real-time PCR鉴定内源性基因Oct4、Sox2、NANOG的表达量。采用2-ΔΔCt方法计算各目的基因在各个细胞群的相对表达量，hGAPDH为内参，H1为参照样本。ΔΔCt（目的基因，细胞群）=（Ct目的基因-CtGAPDH）细胞群-（Ct目的基因-CtGAPDH）H1。

1.2.6核型鉴定分别取两组质粒诱导形成的iPS细胞进行核型鉴定。使用HE染色，随机选取中期分裂相的细胞20个以上进行核型正确率统计。人正常为46条染色体，一般认为有70%～80%的细胞染色体为46条时，此hiPS细胞系则为较好的细胞系。通过染色体核型显带进行核型分析。

1.2.7畸胎瘤形成实验分别选取核型鉴定正常的重编程的iPS细胞传代扩增，传至第9代时，accutase进行消化去掉杂细胞，加入PBS终止消化。约5×106细胞重悬到PBS与Matrigel solution（1∶1）稀释的200μL的溶液中，注射到NOD/SCID免疫缺陷小鼠腋窝皮下，2个月左右可观察到畸胎瘤形成，取下畸胎瘤，10%甲醛固定24 h，石蜡包埋，HE染色，显微镜下观察畸胎瘤组织形态。

1.3统计学方法

采用GraphPad Prism 5.0软件处理分析结果数据，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1重编程过程中克隆形态变化及诱导效率观察

两种游离型载体pEB-C5（C5）+pEB-Tg（Tg）和pEV SFFV-OS（OS）+pEV SFFV-MK（MK）+pEV SFFV-B（B）重编程CB CD34+细胞形成的iPSCs的过程中，细胞核转染第9天时，显微镜下即可看到iPS克隆的初始形态；第14天时，完全重编程的克隆使用TRA-1-60活染鉴定，倒置荧光显微镜下观察TRA-1-60+克隆形态，取阳性克隆传代培养并观察形态变化（图2），发现与hESC克隆非常相似，计数克隆总数和TRA-1-60+克隆数，6孔板的每个孔（2×106CB CD34+细胞）可观察到约900个类似ES细胞的克隆，TRA-1-60+克隆约450个，克隆效率（即TRA-1-60+克隆数/克隆总数）约为50%（图3）。

图2　CB CD34+细胞重编程克隆形态图

图3　两组质粒重编程效率比较

2.2重编程的hiPSCs多能性基因的鉴定

利用pEB-C5、pEB-Tg和pEV SFFV-OS、pEV SFFV-MK、pEV SFFV-B两组质粒分别诱导CB CD34+形成hiPSCs经免疫荧光染色显示，hiPSCs高表达多潜能标记基因Oct4和NANOG和未分化特异性膜表面标记基因TRA-1-60和SSEA4（图4）。实时定量荧光PCR显示，hiPSCs多能性基因OCT4、SOX2、NANOG的表达量与hES细胞系H1相比，表达量比较接近，差异无统计学意义（P＞0.05），而与CD34+细胞相比，差异有统计学意义（P＜0.05），见图5。

图4　免疫荧光染色鉴定（免疫荧光染色，10伊）

相对表达量

2.3核型鉴定结果

两组非整合型质粒重编程CB CD34+细胞形成的iPSCs，细胞核型分析发现，染色体为46条细胞比例在70%～80%之间，且核型和正常人的细胞核型相同，即（46，XX）（图6），说明重编程的细胞核型正常。

图6　hiPSCs核型鉴定图

2.4畸胎瘤形成结果

利用畸胎瘤形成的方法对所建立的iPS细胞进行体内分化潜能检测，发现8～12周时取出免疫缺陷小鼠皮下直径约2 cm畸胎瘤，行病理切片HE染色，结果显示具有三胚层结构，说明来源于CB CD34+细胞的iPS细胞在免疫缺陷小鼠体内具有形成三胚层结构的能力（图7），重编程的hiPSCs具有分化多能性。

3　讨论

为了提高重编程的iPS细胞的安全性使其易于走向临床应用，人们在诱导iPSC技术方面进行了深入的探索，Nakagawa等［12］和Wernig等［13］发现，诱导iPS细胞过程中可以将过表达会导致细胞恶性转变的c-MYC基因［14］剔除，避免了c-MYC原癌基因的插入。研究者们发现，重编程介导的载体和媒介从腺病毒到脂质体、质粒再到后来的蛋白载体［3，15］，一定程度上降低了病毒载体带来的风险，但使用蛋白和mRNAs重编程靶细胞，效率较低，使用不方便，不易推广使用。近年来越来越多的研究者［16-19］发现，利用非整合的游离型载体重编程人体细胞形成iPSCs，不会改变基因组序列，进一步降低了致瘤的风险，重编程的iPS细胞的安全性较高，使其易于走向临床应用。

图7　畸胎瘤检测hiPSC体内分化多能性（HE，100×）

本研究利用两组非整合型质粒pEB-C5、pEB-Tg和pEV SFFV-OS、pEV SFFV-MK、pEVSFFV-B分别重编程人脐带血来源的CD34+细胞形成了质粒非整合型hiPSCs。两种方法重编程效果基本相同，周期较短，效果较高，且血液细胞只需培养8～9 d即可进行细胞核转染，转染2周左右即可挑克隆传代培养。通过一次质粒转染即可成功重编程目的细胞，方法简便，易于推广使用。并且诱导过程中，加入丁酸钠［20］可以提高诱导效率。游离型载体EBNA1/OriP［8，21］不会改变基因组遗传信息，该方法建立的iPS细胞为质粒非整合型iPS细胞，更有可能走向临床应用。重编程的hiPSCs经细胞免疫荧光染色和实时荧光定量PCR检测证明表达胚胎干细胞多能性标志基因，细胞核型鉴定为正常核型，且具有体内形成三胚层结构的能力。以上体内外实验证明诱导重编程的iPSCs与ES细胞有相似的特性。利用非整合型质粒重编程血液细胞形成hiPSCs有可能代替ES细胞应用于临床治疗和科学研究，为hiPSC用于疾病模型的研究和临床应用等提供了更好的前景。

［1］Takahashi K，Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors［J］.Cell，2006，126（4）：663-676.

［2］SekiT，YuasaS，OdaM，etal.Generationofinducedpluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells［J］.Cell Stem Cell，2010，7（1）：11-14.

［3］OkitaK，NakagawaM，HyenjongH，etal.Generationofmouse induced pluripotent stem cells without viral vectors［J］. Science，2008，322（5903）：949-953.

［4］Yu J，Hu K，Smuga-Otto K，etal.Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences［J］.Science，2009，324（5928）：797-801.

［5］MarchettoMC，Yeo GW，Kainohana O，etal.Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells［J］.PLoSOne，2009，4（9）：e7076.

［6］Jia F，Wilson KD，Sun N，et al.A nonviralminicircle vector for deriving human iPS cells［J］.NatMethods，2010，7（3）：197-199.

［7］Warren L，Manos PD，Ahfeldt T，et al.Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA［J］.Cell Stem Cell，2010，7（5）：618-630.

［8］Chou BK，Mali P，Huang X，et al.Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures［J］. Cell Res，2011，21（3）：518-529.

［9］Zhou H，Wu S，Joo JY，etal.Generationofinduced pluripotent stem cells using recombinant proteins［J］.Cell Stem Cell，2009，4（5）：381-384.

［10］Kim D，Kim CH，Moon JI，etal.Generationofhuman induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogrammingproteins［J］.CellStem Cell，2009，4（6）：472-476.

［11］Meng X，Neises A，Su R J，et al.Efficient reprogramming of human cord blood CD34+cells into induced pluripotent stem cellswith OCT4 and SOX2 alone［J］.Mol Ther，2012，20（2）：408-416.

［12］Nakagawa M，KoyanagiM，Tanabe K，et al.Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts［J］.Nat Biotechnol，2008，26（1）：101-106.

［13］WernigM，MeissnerA，Cassady JP，etal.c-Myc isdispensable for direct reprogramming of mouse fibroblasts［J］.Cell Stem Cell，2008，2（1）：10-12.

［14］Adhikary S，Eilers M.Transcriptional regulation and transformation by Myc proteins［J］.NatRev Mol Cell Biol，2005，6（8）：635-645.

［15］Stadtfeld M，Nagaya M，Utikal J，etal.Induced pluripotent stem cells generated without viral integration［J］.Science，2008，322（5903）：945-949.

［16］Slamecka J，Salimova L，McClellan S，et al.Nonintegrating episomal plasmid-based reprogramming of human amniotic fluid stem cells into induced pluripotent stem cells in chemically defined conditions［J］.CellCycle，2016，15（2）：234-249.

［17］Kime C，Rand TA，Ivey KN，et al.Practical Integration-Free Episomal Methods for Generating Human Induced Pluripotent Stem Cells［J］.Curr Protoc Hum Genet，2015，87：21.2.1-21.

［18］Manzini S，Viiri LE，Marttila S，et al.A Comparative View on Easy to Deploy non-Integrating Methods for Patient-Specific iPSCProduction［J］.Stem Cell Rev，2015，11（6）：900-908.

［19］Meraviglia V，Zanon A，Lavdas AA，et al.Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids［J］.JVis Exp，2015，2015（100）：e52885.

［20］Mali P，Chou BK，Yen J，et al.Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes［J］.Stem Cells，2010，28（4）：713-720.

［21］Lindner SE，Sugden B.The plasmid replicon of Epstein-Barr virus：mechanistic insights into efficient，licensed，extrachromosomal replication in human cells［J］.Plasmid，2007，58（1）：1-12.

Two efficient eepeogeamm ing methods of human coed v lood CD34+cells induced p lueipotent stem cellsw ith non-integeating plasm id system

ZHANGQuan＇e SHIWenting TAOHong HEZhengmei DING Banghe WANGChunling YU Liang LIYufeng

Department of Hematology，Huai＇an First People＇s Hospital，Nanjing Medical University，Jiangsu Province，Huai＇an 223300，China

R457

A

1674-4721（2016）08（c）-0021-06

2016-05-21本文编辑：程铭）

江苏省“333工程”培养资金资助项目（BRA2015152）；江苏省淮安市科技计划专项资金项目（HAS2015026）。

丁邦和（1968.11-），男，副主任医师；研究方向：血液病学。