m iR-140-5p调控FGF9在拇外翻中的作用

罗纯猛　金日龙　杜　健　李　力　马　健　佟智慧.辽宁省抚顺市中心医：骨科外二科，辽宁抚顺3006；.中国医科大学附属第一医：骨科，辽宁沈阳000

m iR-140-5p调控FGF9在拇外翻中的作用

罗纯猛1金日龙1杜健2李力1马健1佟智慧1
1.辽宁省抚顺市中心医：骨科外二科，辽宁抚顺113006；2.中国医科大学附属第一医：骨科，辽宁沈阳110001

目的探讨miR-140-5p调控FGF9在拇外翻中的作用，从基因层面阐明拇外翻的发病机制，为临床预防和治疗拇外翻提供基础理论依据。方法收集2013～2015年于抚顺市中心医：就诊的拇外翻患者（10例）和非拇外翻患者（5例）的第一跖骨内侧骨组织及表面软组织样本，运用Western blot以及real-time PCR检测各组织中miR-140-5p和FGF9的表达，并对其表达差异进行分析。利用人成骨细胞系hFOB1.19对骨保护素（OPG）和骨钙素（OCN）进行Western blot分析，验证miR-140-5p和FGF9的调控关系和对成骨细胞成骨能力的影响。结果拇外翻患者第一跖趾关节与非拇外翻患者比较，miR-140-5p表达显著下降（P=0.0065），FGF9表达明显增高（P= 0.0055）。上调miR-140-5p后FGF9mRNA表达显著下降（P=0.0050），而下调miR-140-5p后FGF9mRNA表达显著增加（P=0.0035）。与未转染组比较上调miR-140-5p后OPG（P=0.0045）和OCN蛋白（P=0.0037）表达明显增强，而下调miR-140-5p后OPG（P=0.0047）和OCN蛋白（P=0.0049）表达减弱。结论本研究初步证明了miR-140-5p与FGF9在拇外翻的病理过程中具有重要作用，这为拇外翻的病因以及诊治研究提供了新的方向。[关键词]拇外翻；m iR-140-5p；FGF9；成骨细胞

［Avsteact］Ovjective To discuss effects ofmiR-140-5p on FGF9 in hallux valgus，illuminate the pathogenesis of hallux valgus from the point of gene，which provides basic theoretical foundation for the treatment and prevention of hallux valgus.M ethods Samples of patientswith hallux valgus（10 cases）and without hallux valgus（5 cases）in the Fushun Central Hospital from 2013 to 2015 were collected，thus the expression of miR-140-5p and FGF9 in the first metatarsalmedial bone tissues and the surface of the soft tissueswere analyzed with Western blot and real-time PCR. Besides，Western blot analysis on OPG and OCN with osteoblast cell line hFOB1.19 were conducted；the effects and regulation relationship betweenmiR-140-5p and FGF9 on the osteogenic capacity of osteoblast cell line were verified. Results Compared with the first plantar toe joint of the patients without hallux valgus，themiR-140-5p of hallux valgus patients reduced remarkably（P=0.0065），FGF9mRNA increased obviously（P=0.0055）.After the increasing of miR-140-5p，FGF9mRNA was reduced remarkably（P=0.0050），and after the reducing ofmiR-140-5p，FGF9mRNA was increased remarkably（P=0.0035）.Compared with the untransfected group，OPG（P=0.0045）and OCN（P= 0.0037）protein increased aftermiR-140-5p was increased.While the decrease ofmiR-140-5p caused the weaken of OPG（P=0.0047）and OCN protein（P=0.0049）.Conclusion This experiment primarily proves the important functions thatmiR-140-5p and FGF9 having in the pathological process of hallux valgus，which provides new direction for the pathogenesis and diagnosis of hallux valgus.

［Key woeds］Hallux valgus；miR-140-5p；FGF9；Osteoblast

拇外翻是指拇趾偏离中线，向外倾斜大于正常生理性拇外翻角度，同时拇趾在纵轴上向外略有旋转畸形。由于其复杂的解剖畸形给拇外翻的治疗带来很大的困难，而且拇外翻畸形严重影响患者的生活质量，还可能会进一步导致踝关节、膝关节以及髋关节的畸形［1］。拇外翻最为主要的病理改变为第一跖骨内翻合并跖骨头内侧骨赘增生和拇囊炎［2-7］。但是该病理改变发病机制一直未被研究清楚，有研究表明，成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factors，FGF）可以刺激的第一跖趾关节的软组织增生，这为拇外翻的病理学研究提供了一个新的方向［8］。对FGFs的研究可能会阐明拇外翻骨赘形成的原因。

现有报道指出遗传因素是拇外翻的最主要的内部因素，研究发现拇外翻的患者很多都有家族史，遗传获得的体型及体质可构成特定的生物力学结构及功能，在一定诱因的影响下可导致拇外翻的形成［9-10］，但是其具体机制并不明确，而且目前关于拇外翻的基因研究并不多见。已有学者在肝细胞中证实miR-140-5p对于FGF9 mRNA的调控作用［11］，因此推测在人成骨细胞中也存在此调控机制。本研究将从首次以拇外翻患者多余骨赘中miR-140-5p以及FGF9的差异表达入手，并应用人体成骨细胞验证miR-140-5p对FGF9的调控作用和对成骨细胞成骨功能的影响，目的是明确拇外翻和miR-140-5p、FGF9之间的关系，进一步探索拇外翻发病机制。

1　对象与方法

1.1对象

选择2013～2015年于抚顺市中心医：（以下简称“我：”）就诊的10例拇外翻患者，其中女9例，男1例，年龄20～75岁。选择同期我：收治的因车祸至下肢血运严重受损并导致截肢的5例非拇外翻患者，其中女3例，男2例，年龄20～60岁。术前获得患者的同意并签署知情同意书，拇外翻患者矫形手术中切除第一跖骨头内侧骨赘带表面软组织，非拇外翻患者取第一跖骨头内侧骨组织及表面软组织。本研究经辽宁省医学伦理委员会批准。

1.2细胞培养

人成骨细胞株（hFOB1.19）购自中国科学：上海细胞所细胞库，培养基为DMEM∶F12=1∶1（Gibco），胎牛血清（上海洛神生物技术有限公司）。hFOB1.19需在34℃，5%CO2的条件下培养，培养基为DMEM∶F12=1∶1，添加终浓度为10%的胎牛血清及终浓度为0.3‰的G418（Amersco）。隔1 d换液1次。

1.3采用慢病毒转染的方法上下调控m iR-140-5p的表达

由绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）标记，编码has-miR-140-5p反义寡核苷酸链的慢病毒（lentivirus，LV）由上海吉凯基因化学技术公司包装，分别用于体外培养hFOB 1.19细胞表达miR-140-5p的上调（LV-pre-miR-140-5p）或下调（anti-LV-miR-140-5p）。GFP标记的空白慢病毒载体（LV-null）用作空白对照。以感染复数（MOI）=10进行转染。根据不同转染情况分为：未进行慢病毒转染的正常hFOB 1.19细胞作为未转染组；转染了LV-premiR-140-5p的hFOB 1.19细胞作为上调组；转染了anti-LV-miR-140-5p的hFOB 1.19细胞作为下调组；转染了LV-null的hFOB 1.19细胞作为上调对照组；转染了anti-LV-null的hFOB 1.19细胞作为下调对照组。

1.4采用免疫组化检测FGF9的表达

切片：经取材后取得的组织置于多聚甲醛内固定4 h后，后置于30%蔗糖溶液浸泡1周左右，使组织沉至溶液底部。制作蜡块：应用蜡块切片机做正中矢状面切片，厚度为10μm。切片后室温放置1 h。应用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法对组织进行形态学分析。FGF9抗体购于Abcam公司（货号：ab71395），采用微波法修复抗原，并且应用DAB法进行显色，最终通过激光共聚焦显微镜观察拍照，并且应用Qwin（v2.3，Leica Inc.，德国）软件对拍摄结果进行定量分析用以判断整体组织中FGF9的表达情况。

1.5采用real-time PCR检测m iR-140-5p和FGF9 mRNA的表达

real-time PCR所用引物序列见表1。首先应用Trizol法提取样本中的总RNA并且测定OD260/OD280值以及RNA浓度，应用Invitrogen（货号：C28025-032）反转录试剂盒进行反转录cDNA，下一步使用TAKARA的SYBR Premis Ex TaqⅡ（Perfect Real Time）试剂盒进行real time PCR反应，样本通过94℃预变性2 min、94℃变性20 s、58℃退火20 s、72℃延伸30 s、74℃读板、共40个循环后得到一个平均Ct值，通过该数值来计算mRNA的相对含量。最终结果运用Comparative Delta-delta Ct法即ΔΔCt法进行相对定量分析，用来判断miR-140-5p和FGF9mRNA的相对表达量。

表1　Rea l tim e-PCR引物序列

1.6采用Western blot检测骨保护素（OPG）和骨钙素（OCN）的表达

从组织中提取总蛋白，并且应用BCA法进行蛋白定量，之后通过制胶，上样，电泳，转膜，免疫杂交反应，ECL发光，拍照等步骤取得图像，并通过bio-rad的Quantity One软件对结果进行分析，用以判断细胞中OPG和OCN蛋白的表达情况。OPG、OCN抗体购于Abcam公司（货号：ab183910、ab93876）。

1.7统计学方法

采用SPSS 10.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1拇外翻中FGF9与m iR-140-5p的关系

免疫组化实验结果显示，非拇外翻患者及拇外翻患者骨组织中均有FGF9表达，拇外翻患者骨组织中FGF9的表达量明显高于非拇外翻患者（P=0.0055）（图1A）。拇外翻患者组织中miR-140-5p的表达量明显低于非拇外翻患者（P=0.0065）（图1B）。

图1　拇外翻及非拇外翻患者骨组织中FGF9与m iR-140-5p的表达情况（SP染色，400×）

2.2成骨细胞中m iR-140-5p对FGF9的调控作用

在上调了miR-140-5p的表达之后，采用real time-PCR观察miR-140-5p和FGF9mRNA的表达，发现与未转染组比较上调组中miR-140-5p mRNA的表达显著升高（P=0.0052）（图2A），而FGF9 mRNA的表达明显下降（P=0.0050）（见图2B）。在下调了miR-140-5p mRNA的表达之后，发现与未转染组比较下调组中miR-140-5p的表达显著降低（P= 0.0056）（见图2A），而FGF9 mRNA的表达明显增强（P=0.0045）（图2B）。

图2　成骨细胞中m iR-140-5p和FGF9 m RNA的表达情况

2.3m iR-140-5p和FGF9对成骨细胞成骨功能的影响

Western blot结果显示，与未转染组比较，下调miR-140-5p的表达之后，OCN（P=0.0049）和OPG（P=0.0047）蛋白表达水平均明显降低，而上调miR-140-5p的表达之后，OCN（P=0.0037）和OPG（P= 0.0045）蛋白表达水平均显著提高。见图3。

图3　成骨细胞中OPG和OCN的表达情况

3　讨论

miR-140-5p已经被证实在多种疾病中均具有重要作用，对于其功能研究主要集中在肿瘤方面，其作为下游靶蛋白抑制因素，在多种肿瘤的发生与发展过程中具有重要作用［12-13］。不仅如此，miR-140-5p在免疫系统中的作用也已得到验证［14］。在骨科的相关疾病中miR-140-5p也发挥着重要作用，在骨折愈合方面，通过基因芯片分析发现，在骨折的大鼠体内miR-140-5p的表达显著增高［15］。有报道指出miR-140-5p在骨关节炎大鼠的病理发展过程中具有重要作用［16］。但是目前miR-140-5p与拇外翻之间相关性并没有被明确。本研究发现miR-140-5p在非拇外翻患者与拇外翻患者之间的差异表达。虽然之前已有学者在肝癌细胞中发现miR-140-5p可以调控FGF9mRNA的表达［11］，但是在成骨细胞中验证他们两者之间的调控关系并不多见。本研究初步对拇外翻的发病机制进行探讨，这为拇外翻的治疗以及预防提出了新的方向。

多余骨赘形成是拇外翻和拇囊炎的主要病因，但是其具体机制并不明确。现有报道指出FGFs可以刺激拇外翻患者第一跖趾关节软组织中的间充质细胞增殖并且可能与拇外翻的发病具有密切关系［8］。到目前为止，FGFs家族中有23个家族成员被发现。FGFs来源于有脊椎和无脊椎动物。它包含两个大的内含子序列，两个内含子功能区域可以分为3个外显子区域，这是FGF家庭因素的特点之一。然而FGF 11～14的易位区域包含5个外显子。FGF基因的蛋白质编码区域为5～100 kb［17］。FGFs在膜内成骨以及软骨内成骨的过程中具有重要作用。FGFs可以促进成骨细胞增殖并且抑制破骨细胞分化。FGF9普遍分布在整个脊椎动物身体并具有很多生理功能。现已证实FGF9在多发性骨性连接综合征（SYNS）中具有重要作用［18］并且还可以促进软骨成骨［19］。FGF9还可以通过与FGFR-3结合促进膜内成骨［20］。因此本研究推测拇外翻骨赘形成可能与FGF9促进骨形成作用有关。本实验结果显示，在拇外翻患者的骨赘组织中FGF9的表达高于非拇外翻患者。并且成骨细胞的功能随着FGF9的表达增高而增强。

成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。拇外翻患者第一跖趾关节处多余骨赘的形成标志着成骨细胞成骨能力的亢进。所以对于成骨细胞成骨能力的观察是研究拇外翻病因的关键。OCN是骨矿化过程中必不可少的，其可以促进骨形成，本研究应用OCN检测hFOB1.19细胞骨形成指标。NF-κB配体的受体（RANKL）是破骨细胞生成、激活及存活必不可少的因素，而OPG是RANKL的可溶性诱饵受体，可以抑制RANKL对破骨细胞的作用［21］，因此本研究应用OPG检测hFOB1.19细胞骨吸收指标。通过上述指标充分反映成骨细胞的成骨能力。本研究发现成骨细胞的成骨能力与FGF9和miR-140-5p之间存在相关性。这也预示着FGF9和miR-140-5p可能是拇外翻畸形过程中的关键因素。

本实验明确了在拇外翻患者中miR-140-5p表达降低，导致FGF9表达增强并刺激第一跖趾关节局部骨组织异常增生，导致多余骨赘形成。目前对于拇外翻发病机制的研究并不多见，本实验初步证明了miR-140-5p与FGF9在拇外翻的病理过程中具有重要作用，但是明确拇外翻的具体发病机制还需要更深入的研究，希望本实验可以为拇外翻的病因以及诊治研究提供一个新的方向。

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Effect of FGF9 eegulated vy m iR-140-5p on hallux valgus

LUO Chunmeng1JIN Rilong1DU Jian2LILi1MA Jian1TONG Zhihui1

1.The Second Surgical Department of Orthopedics，the Fushun Central Hospital，Liaoning Province，Fushun 113006，China；2.Department of Orthopedics，the First Affiliated Hospital of China Medical University，Liaoning Province，Shenyang 110001，China

R687.3

A

1674-4721（2016）08（c）-0004-05

2016-06-10本文编辑：任念）

国家自然科学基金资助项目（81471094）。

佟智慧（1966.2-），男，硕士，主任医师；研究方向：脊柱外科。