武当山区不同采收期宽叶重楼地上部分总黄酮的累积规律

杨金霞　张　慧　叶　方▲　黄良永　孙良学　雷　攀1.湖北省十堰市太和医：湖北医药学：附属医：药学部，湖北十堰2000；2.湖北医药学：湖北省药用植物综合利用工程技术研究中心，湖北十堰2000；.湖北中医药大学药学：，湖北武汉006；.湖北济世药业有限责任公司，湖北十堰2000

武当山区不同采收期宽叶重楼地上部分总黄酮的累积规律

杨金霞1，2张慧3叶方1，2▲黄良永1，2孙良学4雷攀1，2
1.湖北省十堰市太和医：湖北医药学：附属医：药学部，湖北十堰442000；2.湖北医药学：湖北省药用植物综合利用工程技术研究中心，湖北十堰442000；3.湖北中医药大学药学：，湖北武汉430064；4.湖北济世药业有限责任公司，湖北十堰442000

目的以武当山区野生转家种宽叶重楼为样本，测定宽叶重楼不同采收期地上部分总黄酮含量，研究总黄酮累积规律。方法根据黄酮与Al3+络合形成稳定络合荧光物质的特点，以芦丁为标准品，采用荧光光度法测定宽叶重楼地上部分的黄酮含量。结果宽叶重楼地上部分总黄酮含量在4月上旬最高，随后呈降低趋势，到6月下旬种子开始发育时含量升高，然后再下降，到7月下旬最低。4月上旬、下旬，5、6、7、9月总黄酮含量分别为1.11%、0.76%、0.47%、0.70%、0.19%、0.53%。结论以总黄酮含量为考察指标，考虑到植株生长发育的实际因素，宽叶重楼地上部分可在6月中下旬采收。

宽叶重楼；荧光光度法；地上部分；总黄酮；累积规律

［Avsteact］Ovjective To study the dynamic change of total flavonoids in aerial parts of PaTis polyphylla var.latifolia in Wudang Mountain area，and to explore the optimal harvest period of PaTis polyphylla var.latifolia.M ethods According to the characteristic that flavonoids could reactwith Al3+to form stable flurescent complex，taking rutin as the standard sample，and fluorescence spectrophotometric method to determine the content of total flavonoids was used in the aerial parts of PaTis polyphylla var.latifolia in different harvest periods.Results The content of total flavonoids reached highest level in early April，after that it had a trend to decrease，but it increased and then decreased in the last June，and reached the lowest in late July.The content of early April，late April，May，June，July，September was 1.11%，0.76%，0.47%，0.70%，0.19%，0.53%respectively.Conclusion The optimal harvest period of PaTis polyphylla var.latifolia in Wudang Mountain area is confirmed in mid to late June，for the content of total flavonoids as reference indexes with considering the actual factors.

［Key woeds］PaTis polyphylla var.latifolia；Fluorescence spectrophotometry；Aerial parts；Total flavonoids；Accumulative rules

重楼（Paridis Rhizoma）是百合科重楼属植物，始载于《神农本草经》，称“蚤休”，列为下品［1］。味苦，性微寒，有小毒，归肝经，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊的功效［2］。现代药理研究证明重楼具有抗肿瘤、止血止痛［3-4］、抗炎抑菌、心血管系统作用［5］等药理活性，其活性成分有重楼总皂苷和黄酮类化合物［6］。重楼主要分布于亚欧大陆的温带、亚热带地区［7］，约有10个品种，我国分布有7种8变种［8］，主要分布于云南、贵州、四川、湖北等地。武当山区分布有2种6变种［9］，主要有七叶一枝花（华重楼）、滇重楼、球药隔重楼、长药隔重楼、狭叶重楼、宽叶重楼等。重楼是多年生草本，对生长环境要求较高，不同的海拔高度、气温、气候、土壤等因素都可能影响重楼质量及产量［10］。另外，山体走向也会影响其生长，同样是高海拔地区，重楼喜背阴坡，而朝阳坡基本不生长，且需要腐殖质丰富的土壤。武当山区以其独特的地理气候环境，适于重楼等药用植物的生长［9］。重楼的主要药用部位是根茎，主要药用成分是甾体皂苷类，一般需要种植5年以上才能药用。而重楼每年生长的地上部分没有得到利用，造成资源浪费［11］。

黄酮类化合物是重楼的化学成分之一［12］。黄酮类化合物具有抗心律失常、抗血脂、镇静、抗抑郁、抗菌抗病毒、免疫调节等作用，目前含有黄酮类化合物的药物有很多，如舒血宁片、心脉舒通等［13］。通过研究重楼中黄酮类化合物的分布情况有可能开发新的药用资源，使重楼地上部分得到合理应用。本次试验采用荧光光度法，测定重楼地上部分黄酮含量，研究总黄酮的累积规律，根据各地重楼的黄酮累积规律合理确定采收时间，以合理利用资源。

1　仪器与试药

1.1仪器

荧光光谱仪（日立F-7000），电子分析天平（FA-2004，上海精密仪器），数字式酸度计（PHSJ-A，上海雷磁仪器），电热恒温水浴箱（HW1A，北京医疗设备厂）。

1.2试药

芦丁标准品（中国食品药品检定研究：，100080-201408，供含量测定用，92.8%）。

重楼药材采自武当山区龙王寨重楼种植基地，由湖北医药学：药学：叶方副教授鉴定，样本保存在湖北医药学：附属十堰市太和医：药学部标本室。其样品基源地及产地信息见表1。药材洗净，50℃烘干，粉碎过3号筛备用。硝酸铝、醋酸钠、冰乙酸均为分析纯，水为自制去离子水。

表1　样品基源及产地信息和含量测定结果

2　方法与结果

2.1对照品的制备

精密称取芦丁对照品10.3 mg于50 mL容量瓶中，用60%的乙醇溶解，定容至刻度，摇匀，得浓度为0.2060mg/mL的对照品溶液。

2.2供试品的制备

精密称取重楼地上部分干燥粉末1 g，置于100mL锥形瓶中，加入25mL石油醚，60℃水浴回流2 h，弃去石油醚液，药渣挥干后加入60%乙醇30 mL，80℃水浴回流2 h。滤过，滤渣用60%乙醇洗涤3次，滤液定容至50mL容量瓶中，摇匀，得到样品提取液A1～A6［14］。

2.3测定方法及检测波长的确定

精密量取“2.1”项下对照品溶液0.5 mL于10 mL容量瓶中，加入10%硝酸铝溶液1mL，pH=4的HAc-NaAc缓冲溶液3mL，用60%乙醇定容至刻度。精密量取A1溶液0.5mL于10mL容量瓶中，同法操作［14-15］。固定激发波长（λex），在200～700 nm范围内进行对照品和样品溶液荧光扫描，确定发射波长（λem），结果最佳λem为484 nm，见图1～2；固定λem为484 nm，扫描λex在200～700 nm范围内对照品及样品溶液荧光强度，结果最佳λex为445 nm，见图3～4。确定检测波长：λex为445 nm，λem为484 nm，狭缝宽度为2.5 nm。

图1　芦丁标准品：固定激发波长扫描发射波长

图2　样品溶液：固定激发波长扫描发射波长

图3　芦丁标准品：固定发射波长扫描激发波长

图4　样品溶液：固定发射波长扫描激发波长

2.4方法学考察

2.4.1标准曲线的考察分别精密移取芦丁对照品溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mL，置于10 mL容量瓶中，加入10%的硝酸铝溶液1 mL，pH=4的HAc-NaAc缓冲溶液3 mL，用60%乙醇定容，摇匀，静置25 min，即配成标准工作溶液。以60%乙醇溶液为空白对照，在固定激发波长为445 nm，发射波长为484 nm，狭缝宽度为2.5 nm的条件下，测定荧光强度。以荧光光度值为Y轴，芦丁浓度（μg/mL）为X轴绘制标准曲线，求回归方程。结果芦丁的线性方程为：Y= 0.019 05X+0.0385（T2=0.9968），说明在2.06～32.96μg/mL范围内芦丁浓度与荧光强度呈良好的线性关系。

2.4.2精密度试验取标准品溶液1.0 mL于容量瓶中，按“2.4.1”项下操作，静置25min后，在λex=445 nm，λem=484 nm处连续测定光度值5次，计算RSD值。结果RSD=1.50%。表明仪器精密度良好。

2.4.3重复性试验取1号样品6份，精密量取同样的体积，按“2.4.1”项下操作，测定它们的光度值，计算总黄酮含量，6份样品的平均总黄酮含量为1.11%，RSD值为1.39%。表明重复性良好。

2.4.4稳定性试验取同一样品在0、0.5、1.0、2.0、4.0 h内测定光度值，结果RSD=1.25%。表明样品溶液在4 h内稳定性良好。

2.4.5加样回收率测定精密称取同批次6号药材粉末0.5 g，共计6份，按“2.2”项下提取样品溶液，石油醚挥干后加入浓度为2.6500 mg/mL的芦丁对照品溶液1 mL，同法操作，用60%乙醇定容后按“2.3”项下络合显色。测得其平均回收率为96.87%，RSD为1.48%，说明芦丁的加样回收率符合规定。见表2。

表2　加样回收率试验结果

2.5样品含量测定

在狭缝宽度为2.5 nm、激发波长为λex=445 nm、发射波长λem=484 nm的条件下按“2.3”项下操作方法测定样品中总黄酮的荧光强度，再用回归方程计算含量，结果见表1。

2.6重楼地上部分总黄酮含量动态积累规律结果分析

根据含量测定结果，结合采收时间绘制重楼地上部分总黄酮含量变化曲线图见图5。由图5可知，含量最高的为4月上旬，达到1.11%，然后开始降低，6月下旬花发育成熟出现一个高峰，然后再降低，至7月下旬降到最低，为0.19%，然后又开始上升。

3　讨论

通过对宽叶重楼不同采收期总黄酮含量的测定可以看出，不同采收期总黄酮含量有较大差异。由于重楼是多年生药用植物，根茎繁殖需4～5年采收，种子繁殖需要8～9年采收，周期较长。在人工种植重楼过程中，为了让养分集中供应根茎部位以利生长，一般在5～6月花萼片展开后，及时剪去全部花花萼，以提高产量［16-17］。这样地上部分均被浪费，在野生资源日趋紧张的大环境下，有必要开展药材新资源的研究［18］。如能用宽叶重楼地上部分为原料提取黄酮，对扩大其临床用药的药源具有积极的经济意义。所以如按重楼中黄酮成分考察，可以在6月中下旬采收重楼地上部分。

图5　重楼不同采收期黄酮含量

重楼在许多中药制剂中都有应用，是云南白药、季德胜蛇药片、宫血宁胶囊、楼莲胶囊、热毒清胶囊等重要中成药的主要成分。但在《中国药典》中药用重楼仅为云南重楼和七叶一枝花，各地野生重楼资源下降严重，有的甚至濒临灭绝，所以可以考虑其他民间应用的品种，如多叶重楼、宽叶重楼等替代云南重楼和七叶一枝花。重楼的地上部分生长较快［19］，也可以通过考察地上部分有效成分的含量，挖掘其隐含着药用及经济价值，避免资源浪费。

根据黄酮类化合物能与铝离子反应形成荧光螯合物的原理［20］，可以采用荧光分光光度法测定黄酮类化合物的含量。重楼地上部分含有大量的叶绿素，在样品处理过程中用石油醚除去叶绿素，但可能还是会对黄酮成分的分析存在干扰，本研究采用硝酸铝在酸性条件下与芦丁等黄酮类化合物产生荧光物质的原理，用荧光分光光度法测定总黄酮含量，专属性较高。

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Dynam ic change of total flavonoids in aeeial paets of Paris polyphylla vae. latifolia in vaeious haevest times feom W udang M ountain aeea

YANG Jinxia1，2ZHANG Hui3YE Fang1，2▲HUANG Liangyong1，2SUN Liangxue4LEIPan1，2

1.Department of Pharmacy，Shiyan Taihe Hospital，the Affiliated Hospital of Hubei University of Medicine，Hubei Province，Shiyan 442000，China；2.Engineering Research Center for Herbal Utilization of Hubei Province，Hubei Province，Shiyan 442000，China；3.College of Pharmacy，Hubei University of Chinese Medicine，Hubei Province，Wuhan 430064，China；4.Hubei Jishi Pharmaceutical Co.Ltd.，Hubei Province，Shiyan 442000，China

R927.1

A

1674-4721（2016）08（c）-0016-05

2016-04-20本文编辑：赵鲁枫）

湖北省2011计划（2011JH-2014CXTT13）；湖北省药用植物综合利用工程技术研究中心项目（GC2015204）。