中青年高血压病痰湿壅盛证患者尿液代谢组学分析*

吴天敏　陈金水　薛文娟△　陈玲珊



中青年高血压病痰湿壅盛证患者尿液代谢组学分析*

吴天敏1陈金水1薛文娟1△陈玲珊2

目的寻找中青年高血压病痰湿壅盛证患者的尿液生物标记群，探索其证候本质。方法运用1H NMR结合PLS-DA的方法对中青年高血压病三种证型患者及健康志愿者的尿液进行代谢组学分析，得出生物标记物群。结果中青年高血压病痰湿壅盛组与对照组、肝火亢盛组、阴虚阳亢组对比，痰湿壅盛组代谢物存在显著性变化，主要与三大代谢及嘌呤代谢关系密切。结论运用核磁共振代谢组学方法分析尿液代谢组学，可对中青年高血压病痰湿壅盛患者和健康者、肝火亢盛组、阴虚阳亢组进行区分。

高血压病；痰湿壅盛证；代谢组学；尿液

代谢组学[1]是通过分析生物体系受到外源性或内源性的刺激或扰动后，其代谢产物的变化情况。本研究采用1H NMR结合PLS-DA(partial least squares-discriminate analysis，偏最小二乘法-判别分析)对中青年原发性高血压三种常见证型及健康志愿者的尿液进行全谱分析，确定相关生物标志物。

1　资料与方法

1.1一般资料入选2014年9月—2015年2月就诊福建医科大学附属第一医院高血压患者34例，其中，肝火亢盛组(B组)14例(41.2%)，痰湿壅盛组(C组)14例(41.2%)，阴虚阳亢组(D组)6例(18.6%)。另选择健康人群15人为对照组(A组)。四组性别及年龄资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2诊断标准①高血压病诊断标准参照中华人民共和国卫生部2010年颁布的《中国高血压防治指南》；②中医证候诊断标准参照2002版《中药新药临床指导原则》中《中药新药治疗高血压病的临床研究指导原则》。

1.3纳入标准①符合高血压病西医诊断标准和中医主要3种证候诊断标准；②年龄18～59岁人群；③属于Ⅰ级和Ⅱ级原发性高血压，140mmHg<收缩压<180mmHg且90mmHg<舒张压<110mmHg；④未用药或已服用降血压药物，但经2周洗脱期后血压达到上述标准；⑤签署知情同意书。

1.4排除标准①不符合上述纳入标准；②各种继发性高血压、严重心脑肝肾肺疾患者；③急慢性感染性疾病、糖尿病、恶性肿瘤、严重营养不良患者；④合并有精神病者及孕妇、哺乳期妇女。

1.5材料与方法

1.5.1试剂和仪器3-(三甲基甲硅烷基)丙酸-d4钠盐(TSP)(SIGMA)、重水(D20)(MREDA)、核磁共振波谱仪(AVANCE III 500MHz)(BRUKER)。

1.5.2尿液样品预处理精密移取中段尿300μl，加入缓冲液(PH7.4)200μl、含TSP的重水(TSP/D2O=1mg/1ml)100μl，混匀5min，4℃，12000r/min，离心5min，取上清液500ul，置于5mm核磁管中，送至福州大学测试中心使用AVANCE III 500MHz型核磁共振波谱仪进行核磁共振图谱检测。

1.5.3观察指标尿液代谢组。

1.5.4数据采集和处理在超导傅立叶变NMR谱仪上调用noesygppr1d脉冲序列, 去除尿液中大分子干扰。相关参数：谱宽 6009.615Hz，采样时间 2.0480s，将1H NMR FID(free induction decay, 自由感应衰减)信号导入 Chenomx NMR suit(version 8.0, Chenomx, Edmonton, Canada)软件，自动进行傅立叶转换，调整相位，校正基线，尿液以峰 TSP(0.0ppm)作为全部谱图化学位移的标准。对0.1～10.0 ppm 范围内的谱峰进行分析，以0.04 ppm 单位的化学位移为分段积分单元。为防止水的残留峰干扰，尿液样本除去4.65～4.90ppm(水峰)处的分段积分。再将所有积分值的面积进行归一化处理，导到execl表格中，得到每个分段和对应的积分面积值的矩阵。最后把变量矩阵做为源数据进行后续的PLS-DA。

1.5.5数据分析将存储的数据文件经PLS-DA得到得分图和载荷图，据相应的载荷图寻找不同证型较大的变量(化学位移)，确定两组之间的共性代谢物和差异生物标记物。将有差异的代谢物输入KEGG数据库，得出每种代谢物涉及的代谢途径。

2　结果

2.1痰湿壅盛组与对照组分析比较

2.1.1PLS-DA分析痰湿壅盛组与对照组PLS-DA

得分图如图1，两组之间存在较显著差异。载荷图如图2显示两组之间的差异化学位移点，其离中心点越远，则对区分样本所做的贡献越大。根据差异化学位移点得出其所代表的化合物，经过t检验，得出两组有显著差异的化合物(P<0.05)。

图1　C组与A组得分图

图2　C组与A组载荷图

2.1.2代谢物成分分析表2得出高血压病痰湿壅盛组与对照组之间有显著差异的化合物：尿素、柠檬酸盐、乙醇胺、π-甲基组氨酸、谷氨酰胺、肌酸。将上述6种化合物输入KEGG数据库，说明主要涉及氨基酸代谢、糖代谢、脂代谢、核酸代谢。

表2　C组与A组之间有显著性差异的化合物涉及到的代谢途径

2.2痰湿壅盛组与肝火亢盛组分析比较

2.2.1PLS-DA分析通过痰湿壅盛组与肝火亢盛组得分图如图3，发现两组之间存在显著差异。载荷图如图4显示的是两组之间的差异化学位移点，得出其所代表的化合物，经过t检验得出两组有显著差异的化合物(P<0.05)，见表3。

图3　C组与B组得分图

图4　C组与B组载荷图

KEGG编号化合物代谢途径功能分类变化趋势K01427尿素嘌呤代谢精氨酸和脯氨酸代谢核酸代谢氨基酸代谢↑K01470肌酐精氨酸和脯氨酸代谢氨基酸代谢↓K00894乙醇胺甘油磷脂代谢脂代谢↓K00933肌酸精氨酸和脯氨酸代谢氨基酸代谢↓K01451马尿酸苯丙氨酸代谢氨基酸代谢↓K00270苯丙氨酸酪氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸代谢氨基酸代谢↓

2.2.2代谢物成分分析表3得出高血压病痰湿壅盛组与肝火亢盛组间存在差异的化合物有：尿素、肌酐、乙醇胺、肌酸、马尿酸、苯丙氨酸。将上述6种化合物输入KEGG数据库，说明两组主要涉及到的代谢途径包括氨基酸代谢、脂代谢、核酸代谢等。

2.3痰湿壅盛组与阴虚阳亢组分析比较

2.3.1PLS-DA分析痰湿壅盛组与阴虚阳亢组得分图如图5，发现两组间存在显著的差异。载荷图如图6显示两组之间的差异化学位移点，得出所代表的化合物，经过t检验得出两组有显著差异的化合物(P<0.05)，见表4。

图5　C组与D组得分图

图6　C组与D组载荷图

2.3.2代谢物成分分析表4得出高血压病痰湿壅盛组与肝火亢盛组间存在差异的化合物有：尿素、肌酐、乙醇胺、氧化三甲基、谷氨酰胺、肌酸。将上述6种化合物输入KEGG数据库，发现其主要与三大代谢、核酸代谢有关。

3　讨论

本实验用1H NMR来检测痰湿壅盛组、阴虚阳亢组、肝火亢盛组及对照组尿液代谢物，初步建立中青年高血压病痰湿壅盛证的生物标志物群：尿素、柠檬酸盐、乙醇胺、谷氨酰胺、π-甲基组氨酸、肌酸。痰湿壅盛证与肝火亢盛证有显著性差异的化合物：尿素、肌酐、乙醇胺、肌酸、马尿酸、苯丙氨酸。痰湿壅盛证与阴虚阳亢证有显著性差异的化合物：尿素、肌酐、乙醇胺、氧化三甲胺、谷氨酰胺、肌酸。通过KEGG数据库的查阅，得出其主要与氨基酸、糖类、脂类三大代谢及嘌呤代谢等途径有关。

表4　C组与D组之间有显著性差异的化合物涉及到的代谢途径

尿素的代谢途径包括氨基酸代谢及嘌呤代谢。痰湿壅盛组与其余三组对比尿素显著增高，说明痰湿壅盛证患者氨基酸和(或)嘌呤代谢必然有一环节存在异常[2]，可能与当代中青年大多喜饮酒、吃肉等高嘌呤、高蛋白食物有关，当机体出现嘌呤或氨基酸代谢异常时可引起尿素堆积，而过食肥甘厚腻易致机体内生痰湿，故痰湿壅盛证患者尿素显著高于其他三组。

柠檬酸盐是柠檬酸与水中碳酸盐作用生成。其主要涉及到三羧酸循环与乙醛酸循环，这两个循环中存在着某些相同的酶类和中间产物，其中乙酰CoA占重要位置，而乙酰CoA是经过脂肪酸氧化分解的产物，故脂肪酸代谢异常可能是血压升高的一个重要点[3]。与健康人相比，中青年高血压痰湿壅盛证尿液中柠檬酸盐含量相对较低，与体内乙醛酸循环和三羧酸循环中间的环节出现障碍、机体内能量代谢紊乱有关，当大量脂肪酸氧化分解时，可能导致体内酸性物质沉积，体内酸中毒可导致柠檬酸盐的重吸收增加，使尿中的柠檬酸盐排出减少；酸性物质沉积还可抑制氧化酶类的活性，导致中间产物柠檬酸等在体内堆积，使其在尿液中的水平降低。

乙醇胺与甘油磷脂代谢相关，其可与磷脂酸合成磷脂酰乙醇胺，在肝脏中转变为磷脂酰胆碱。在血液中，胆固醇和脂肪酸可被磷脂酰胆碱化为极细的颗粒从血管中排出，使血流通畅，故磷脂酰胆碱被誉为“血管清道夫”[4]；乙醇胺还为合成扩张血管和降压药物的原料，故推测若机体内乙醇胺降低可间接导致血液中的胆固醇和脂肪酸沉积，血管阻力增高，最终引起血压升高。这可能是高血压病痰湿壅盛证乙醇胺低于对照组的原因。痰湿壅盛证组乙醇胺较肝火亢盛组及阴虚阳亢[5]组显著降低，说明痰湿壅盛证患者普遍存在脂类代谢显著异常，可以推测“痰浊”之邪对脂类代谢影响大。

谷氨酰胺、肌酸、肌酐、马尿酸、苯丙氨酸等涉及到氨基酸代谢。痰湿壅盛证患者常常高脂高糖饮食，这会引起氨基酸代谢异常。正常情况下人体尿液中含有少量的马尿酸，马尿酸为消化道微生物的腐败产物[6]。苯丙氨酸属于必需氨基酸，需要通过食物补充，否则人体机能就不能正常运转。故可以推测痰湿壅盛证组谷氨酰胺、肌酸、肌酐、马尿酸、苯丙氨酸等异常可能与饮食有关，尚待进一步研究。

通过中青年高血压病痰湿壅盛证与肝火亢盛证、阴虚阳亢证对比得出显著性差异的代谢物的代谢途径以三大代谢及嘌呤代谢途径为主，为中青年高血压病痰湿壅盛证的标准化研究提供思路，未来可进一步朝这个方向深入研究，确立高血压病痰湿壅盛证的客观化动态诊断指标，用以指导临床。

[1]Wang J, Zhang L, Wang F, et al. China National Survey of Chronic Kidney Disease Working Group[J]. Prevalence, Awareness, Treatment, and Control of Hypertension in China: Results From a National Survey. American Journal of Hypertension,2014,27(11):1355-1361.

[2]陈广垠，王丽娟，刘君，等.原发性高血压中医证型与相关危险因素的关系[J].中国中医药信息杂志，2012，19(11)：16-18.

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Analysis on Metabolomics of Urine Samples in Young and Middle-aged Patients with Hypertension of Phlegm Dampness Retention Syndrome

WU Tianmin1CHEN Jinshui1XUE Wenjuan1CHEN Lingshan2

(1.Department of Traditional Chinese Medicine, the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fujian, Fuzhou 350005, China；2.Grade 2012 Graduate of Traditional Chinese Medicine and Western Medicine, Fujian Medical University, Fujian, Fuzhou 350005, China)

ObjectiveTo analyze the urine samples of young and middle-aged patients with hypertension of phlegm dampness retention syndrome by means of metabonomics, and to confirm its biomarker. MethodThrough the 1HNMR technique combined with partial least squares-discriminate analysis (PLS-DA) method, the biomarkers were selected. ResultThe compounds had significant differences between young and middle-aged patients with hypertension of phlegm dampness retention group and the control group. ConclusionMetabonomics might provide a clear physical basis for distinguishing young and middle-aged patients with hypertension of phlegm dampness retention syndrome and liver-fire hyperactivity syndrome, yin deficiency and yang hyperactivity syndrome, healthy people.

Hypertension; Phlegm dampness retention syndrome; Metabonomics; Urine

福建省中医药科研项目基金(No.wzln201303)

1.福建医科大学附属第一医院中医科(福州 350005)；2.福建医科大学中西医结合临床硕士研究生2012级(福州 350005)

10.3969/j.issn.1003-8914.2016.17.004

1003-8914(2016)-17-2458-04

(本文校对：范柳芳2015-10-18)