CD8+记忆T细胞表达水平及对结核患者与潜在感染者的诊断价值

叶绥艳，刘晓莺，樊海燕

(陕西省榆林市第一医院，陕西 榆林 719000)



CD8+记忆T细胞表达水平及对结核患者与潜在感染者的诊断价值

叶绥艳，刘晓莺，樊海燕

(陕西省榆林市第一医院，陕西 榆林 719000)

目的探讨CD8+记忆T细胞在结核患者与潜在感染者血清中的表达水平及其诊断价值。方法选取30例活动性肺结核患者作为结核(TB)组，选取40例潜在感染者作为潜在感染(LTBI)组；另选取同期来进行体检的健康人作为对照组。取3组受检者外周血，采用流式细胞术检测CD8+记忆T细胞的表达水平，并分析其与IFN-γ释放水平及HRCT评分的关系。结果LTBI组和TB组患者CD8+TCM、CD8+TEMRA细胞亚群表达水平均明显高于对照组(P均<0.05)，CD8+TEM表达水平均明显低于对照组(P均<0.05)；且LTBI组与TB组CD8+T细胞各亚群表达水平比较差异具有统计学意义(P<0.05)。相关性分析显示，IFN-γ释放水平与CD8+TCM细胞亚群表达水平呈正相关性(r=0.319 8,P=0.022 7)；而CD8+记忆T细胞表达水平与HRCT评分呈负相关性(r=-0.273 4，P=0.014 0)。结论CD8+记忆T细胞表达水平的检测有助于结核病的诊断、鉴别诊断、病情程度判断及治疗效果评估，值得在临床上广泛应用。

CD8+记忆T细胞；结核；潜伏感染；诊断价值

结核病(TB)是由结核分枝杆菌感染引起的一种慢性传染病，在世界范围内的病死率较高，目前，临床上尚未完全明确其发病机制，但发现控制和治疗结核病的关键是快速诊疗[1]。近年来研究证实，CD4+T和CD8+T细胞是抗结核保护性免疫主要依赖的细胞，在结核免疫保护中均发挥十分重要的作用[2]。记忆T细胞能再次识别相同抗原而产生二次免疫反应，对特异性抗原具有很强的记忆能力，是机体细胞内病原菌再次感染的预防基础，故记忆T细胞的诱导对高效疫苗的产生十分关键[3]。目前，临床上尚较少有文献报道对结核分枝杆菌抗原特异性记忆T细胞亚群的抗结核免疫作用研究[4]。本研究对活动期结核病患者和潜伏感染者血清中CD8+记忆T细胞的表达情况进行了流式细胞术分析，旨在探讨其在结核病诊断中的价值，为结核病发病机制的了解及防治措施的研发提供一定的参考依据。现将结果报道如下。

1　临床资料

1.1一般资料选取2013年1月—2014年1月我院收治的30例结核病患者作为TB组，经痰涂片抗酸杆菌或结核菌培养阳性确诊为肺结核，以《2001年中华医学会结核病学分会肺结核诊断和治疗指南标准》[5]为诊断依据，男16例，女14例；年龄21～64(38.3±3.5)岁。另收集同期收治PPD皮试和结核分枝杆菌抗原特异性IFN-Y ELISPOT检测阳性的40例潜伏感染者作为LTBI组，患者的临床症状不明显，男22例，女18例；年龄20～62(37.9±3.4)岁。2组均排除感染HIV、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)者，合并心、肝、肾等重要脏器疾病者，合并糖尿病、恶性肿瘤及免疫缺陷疾病者，以及近期(4个月内)使用过免疫抑制剂或激素治疗者。另选择同期我院门诊体检健康者40例作为对照组，PPD皮试和结核分枝杆菌抗原特异性IFN-Y ELISPOT检测均阴性，男20例，女20例；年龄19～64(38.6±4.1)岁。本研究获得我院伦理委员会批准，入选者均签署知情同意书。3组性别、年龄比较差异无统计学意义(P均>0.05)，具有可比性。

1.2方法采用流式细胞仪检测CD8+记忆T细胞亚群在PBMCs中的表达水平。根据CD45RA和CCR7表达情况将CD8+记忆T细胞分为CD45RA-CCR7+中央记忆T细胞(TCM)、CD45RA-CCR7-效应记忆T细胞(TEM)和CD45RA+CCR7-效应记忆T细胞(TEMRA)。3组入组后于清晨空腹状态下各抽取5 mL静脉血，将其置于盛有EDTANa2的抗凝管中，采取Ficoll梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMCs)。分离完成后，在每孔内加入PBMCs细胞悬液200 μL，再依次加入含10%胎牛血清1640培养基、PMA、ionomycin各750 μL、50 ng/mL、1 μg/mL，并充分混匀，然后再孵育1 h。孵育完成后加入浓度为10 μg/mL的Brefeldin A，继续孵育5 h。孵育完成后，采用含2%胎牛血清的PBS缓冲液对PBMCs进行冲洗，结束后依次加入CD8-PC5单克隆抗体、CCR7-PC7抗体、CD45RA-FITC单克隆抗体各3 μL、2.5 μL、7.5 μL，在4 ℃避光的条件下进行标记，约30 min。30 min后采用含2%胎牛血清的PBS缓冲液进行冲洗，再加入500 μL 2%胎牛血清的PBS缓冲液，使细胞悬浮于其中，置于4 ℃避光条件下保存，应设置相应的同型对照。抗体标记后，采用流式细胞仪(BeckmancoulterPC500)对样本进行检测，数据经CellQuest软件分析，记录阳性细胞百分率。分析CD8+记忆T细胞亚群与IFN-γ释放水平、HRCT评分的相关性，IFN-γ水平采用ELISPOT法检测，HRCT评分是专业人员根据CT检查对CT征象进行评分，评分范围为0～168分。

1.3统计学方法所有数据用SPSS 13.0统计学软件分析，采用单因素方差分析Newman-Keuls多重比较试验进行3组间的差异比较，采用直线相关性分析法进行相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.13组CD8+记忆T细胞亚群的表达情况比较与对照组相比，LTBI、TB组患者CD8+TCM、CD8+TEMRA细胞亚群表达水平呈显著增加(P均<0.05)，而CD8+TEM细胞亚群表达水平显著降低(P均<0.05)；且TB组患者的CD8+TCM、CD8+TEMRA细胞亚群表达水平高于LTBI组(P均<0.05)，CD8+TEM表达水平低于LTBI组(P<0.05)。见表1。

表1　3组CD8+记忆T细胞亚群表达情况比较

2.2CD8+记忆T细胞亚群与非特异性抗原刺激后PBMCs中IFN-γ释放水平的相关性经直线相关性分析可知，ELISPOT法检测的IFN-γ释放水平与CD8+TCM表达水平之间呈正相关(r=0.319 8,P=0.022 7)，见图1。而与CD8+TEM表达水平无相关性。

图1　CD8+TCM细胞亚群表达水平与IFN-γ释放水平的相关性

2.3TB患者CD8+记忆T细胞表达水平与HRCT评分的相关性经直线相关性分析可知，CD8+记忆T细胞表达水平与HRCT评分呈负相关(r=-0.273 4，P=0.014 0)。见图2。

图2　CD8+记忆T细胞表达水平与HRCT评分的相关性

3　讨　　论

带菌免疫是结核细胞免疫的主要特点，一旦消除结核菌，特异性细胞免疫也会随之消失，这是由于结核菌初次感染后机体可产生记忆性T细胞，从而发挥抗结核免疫保护作用[5]。目前，临床抗结核免疫功能检测中最常见的是CD4+T细胞和CD8+T细胞，这两种记忆性T细胞在抗结核免疫中发挥的作用至关重要[6]。既往CD4+T细胞及其分泌的细胞因子如IL-2、IFN-γ、TNF-α等介导抗结核免疫保护的作用已被大量学者的研究所证实，被认为是抗结核保护性免疫的重要记忆和功能细胞[7-9]。近年来的研究发现，CD8+T细胞也能发挥很好的抗结核免疫保护作用。Wang等[10]研究发现，在不依赖CD4+T细胞的情况下，尤其是结核分枝杆菌感染的后期阶段，CD8+T细胞可通过激活产生细胞因子而发挥免疫作用。Betts等[11]研究也得出了类似的结论，发现在抗病毒感染中CD8+T细胞发挥了有效的细胞应答作用。

本研究在非特异性抗原刺激CD8+T细胞的同时对细胞表面进行了抗体标记，将CD8+记忆T细胞分为TCM、TEM、TEMRA3种亚型,后两种均为效应记忆T细胞[12]。多数学者的研究发现，TCM、TEM细胞是活动性结核患者体内发挥免疫保护作用的重要CD8+T细胞亚群[13-14]。Streitz等[15]报道，在结核病患者中，CD8+T细胞亚群TCM表达水平高于潜伏感染者，且疫苗研究结果显示疫苗诱导结核病患者产生的抗原特异性记忆性细胞多数为TCM，提示CD8+TCM细胞介导免疫保护。本研究结果显示，TB组患者CD8+TCM、CD8+TEMRA细胞亚群表达水平均高于LTBI、健康人，CD8+TEM细胞亚群表达水平低于LTBI组及健康人，且LTBI与健康人各细胞亚群表达水平也存在较大差异，说明结核病、潜伏感染者及健康人不同人群CD8+T细胞表型的表达水平存在较大差异。这与结核病患者免疫力下降、CD8+T细胞应答能力减弱密切相关，抗原特异性TEMR能直接溶解巨噬细胞而抑制结核菌增殖，故其高水平表达有利于抗结核免疫；TEM细胞表达水平的降低与结核杆菌感染后的破坏密切相关，细胞数量及功能均会受到影响，因而抗结核作用降低。可考虑将CD8+T细胞表达水平作为结核病诊断及与潜伏感染鉴别诊断的指标。

本研究还对CD8+T细胞亚群表达水平与IFN-γ释放水平的相关性进行了分析，结果显示，IFN-γ水平与CD8+TCM表达水平呈现出正相关性，而与CD8+TEM表达水平未呈现出相关性，IFN-γ释放随CD8+T细胞表达水平的增加而增多，进一步提示IFN-γ可能主要由TCM细胞产生，两者表达水平的同时升高预示抗结核免疫感染中结核菌抗原诱导的TCM可发挥重要作用，尤其是二次感染中。本研究针对患者肺部病理学损伤程度进行了HRCT评分，并分析与CD8+T细胞表达水平的相关性，结果发现两者呈负相关性，表明在CD8+T细胞可作为免疫学指标用于TB病情严重程度的诊断。

综上所述，结核病与潜伏感染者CD8+记忆T细胞亚群表达存在较大差异，为两者的临床鉴别诊断提供了新的方法, 值得进一步研究。

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2016-04-10