咖啡酸苯乙酯对糖尿病大鼠血视网膜屏障的影响

袁　鹏　刘学政

天津医学高等专科学校基础医学部　天津　300222；①锦州医科大学



咖啡酸苯乙酯对糖尿病大鼠血视网膜屏障的影响

袁鹏刘学政①

天津医学高等专科学校基础医学部天津300222；①锦州医科大学

①目的观察咖啡酸苯乙酯(CAPE)对糖尿病大鼠血视网膜屏障的影响。②方法将链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠随机分为3组：DM组不使用任何药物；CAPE5组每3天腹腔注射CAPE 5mg/kg；CAPE 10组每 3 天腹腔注射CAPE 10mg/kg；另取正常大鼠作为对照组(CON组)。3个月以后，分光光度计比色法定量分析视网膜示踪物伊凡思蓝的渗漏量，用视网膜干重(mg)标准化伊凡思蓝(ng)含量。③结果4组大鼠视网膜伊凡思蓝渗漏量分别为： CON 组(11.62±3.35)ng/mg； DM 组(54.31±4.89)ng/mg；CAPE5组(29.65±3.88)ng/mg；CAPE10组(26.51±4.05)ng/mg。DM组大鼠视网膜伊凡思蓝渗漏量较CON组增加了3.7倍(P<0.01)，CAPE5组和CAPE10组糖尿病大鼠视网膜伊凡思蓝渗漏量较DM组分别减少了45%(P<0.05)和51%(P<0.05)，但CAPE5组和CAPE10组两组间差异无统计学意义 (P>0.05)。④结论CAPE可对糖尿病大鼠血视网膜屏障的破坏起到保护作用。

糖尿病视网膜病变血视网膜屏障咖啡酸苯乙酯

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病微血管病变和神经性病变在眼底独特环境中的表现，可对视力造成不可挽回的影响，是医学领域亟待解决的难题之一。近年的研究试验证明DR是一种低度的慢性炎症反应性疾病，在微观层次，DR与炎症反应有许多共同点[1]，这些共同点包括毛细血管的扩张、渗出、血流动力学的改变、白细胞的粘附、聚集和迁移等。血视网膜屏障(blood-retinal barrier,BRB)是视网膜组织生理的一个重要组成部分，正常BRB对于维持视网膜的透明性、正常代谢和感光功能必不可少。糖尿病状况下，氧化应激水平升高造成的细胞毒作用和炎症介质介导的白细胞和毛细血管内皮细胞的粘附以及视网膜毛细血管周细胞凋亡是引起BRB破坏的主要原因。研究药物对BRB的保护作用成为DR药物研发的切入点之一。咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester,CAPE)是一种从蜂胶中分离出的酚类物质，具有抗炎、抗氧化应激和免疫调节作用，是一种有效的特异性NF-κB抑制剂[2]。本实验旨在研究CAPE对糖尿病大鼠BRB的保护作用，以初步观察CAPE在治疗DR中的药理作用，为药物治疗DR探索可能的方法。

1　材料与方法

1.1实验动物及材料雄性清洁级SD大鼠40只，体质量200～220g，购自辽宁医学院实验动物中心，于温度为25℃、湿度为40%的动物房普通饲料喂养。CAPE购自美国IL公司，链脲佐菌素(STZ)购自Sigma公司，One Touch II血糖测定仪购自美国强生Lifescan公司，超声波细胞破碎仪(VCX105型,Sonics & materials公司)，真空干燥箱(DZF-150型，南方干燥设备有限公司)，紫外可见分光光度计(UV-2550型，岛津公司)。

1.2模型制备与分组大鼠禁食12小时后,按45mg/kg尾静脉注射1%STZ溶液[0.1mol/L的柠檬酸和柠檬酸钠缓冲液(pH 4.5)配制]；48小时后尾静脉采血测血糖，以后每月测1次，将血糖浓度大于16.7mmol/L的大鼠定为糖尿病模型大鼠。取30只糖尿病模型大鼠随机分为3组，每组10只。DM组不使用任何药物，CAPE 5组每3天腹腔注射CAPE 5mg/kg，CAPE 10组每3天腹腔注射CAPE 10mg/kg。3个月以后3组各剩下8、8、9只大鼠。另取10只SD大鼠,注射等剂量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液作为正常对照组(CON 组)。

1.3BRB破坏的定量分析水合氯醛麻醉大鼠，按30mg/kg体质量自尾静脉注射伊凡思蓝(Evans Blue，EB)，循环2小时后打开胸腔，左心室灌注预热至37℃的柠檬酸钠缓冲液配制的1%多聚甲醛溶液(pH=4.5)，压力为100mmHg，灌注2分钟。灌注后立即取出大鼠眼球，体视镜下分离视网膜，视网膜真空干燥5小时，电子天平称重。将单个视网膜置于120μL甲酰胺中，70℃水浴抽提，18小时后移至超滤离心管中。4℃、12000r/min离心45分钟，取上清液50μL。使用分光光度计分别测量EB在620nm处的最大吸收光值和720nm处的最小吸收光值(每个样品测3次取平均值)。计算净吸光度值=A620nm-A720nm。用视网膜干重(mg)和标准化EB(ng)含量表示，结果为ng/mg。

2　结果

计算出EB在甲酰胺中的标准曲线公式为：y=0.0829x+0.0054。由此计算出各组样品比色值相应EB浓度。

表1　各组大鼠EB渗漏量比较

注：与CON组比较,*P<0.01；与DM组比较,#P<0.05；与CAPE5组比较,※P>0.05

4组大鼠视网膜EB渗漏量差异有统计学意义(F=166.87，P<0.01)。DM组大鼠视网膜EB渗漏量较CON组增加了3.7倍(P<0.01)，CAPE5组和CAPE10组糖尿病大鼠视网膜EB渗漏量较DM组分别减少了45%(P<0.05)和51%(P<0.05)，但CAPE5组和CAPE10组两组间差异无统计学意义,见表 1。

3　讨论

BRB在空间上有内外两层：内层是由视网膜毛细血管内皮细胞及连接组成的内皮性屏障，外层是由视网膜色素上皮细胞及连接组成的上皮性屏障，BRB的破坏是DR早期的特征性病理改变，BRB破坏造成的视网膜血管渗漏在糖尿病患者和STZ诱导的糖尿病大鼠均可观察到。

为数众多的细胞因子和炎性介质参与了BRB的破坏，这些因子由病变组织本身及浸润的白细胞分泌而来，或因BRB的破坏由血清而来，并且相互作用形成网状结构和相互关联的作用通路，共同影响DR的发生和发展。NF-κB是一种参与一系列基因表达调控的核转录因子，在免疫和炎症反应中起着重要作用，糖尿病状况下，升高的炎性介质和高级糖基化终末产物(AGEs)等可作为细胞外信号活化NF-κB[3～5],活化的NF-κB可介导ICAM-1、IL-1β、COX-2和VEGF等与BRB破坏密切相关的细胞因子的表达，被视为糖尿病微血管病变的中心调控因子。

ICAM-1介导的白细胞和视网膜毛细血管内皮细胞之间的粘附被认为在DR的发生、发展中起到始动作用，是DR在微血管水平病理变化的开端，可造成毛细血管内皮损伤、BRB的破坏以及毛细血管无灌注的形成。内源性和外源性血管内皮细胞生长因子(VEGF)均可诱导视网膜血管ICAM-1 的表达[6～8]，VEGF和ICAM-1相互关联，是BRB破坏和视网膜新生血管形成的主要调节因素。早期研究结果表明，使用CAPE后糖尿病大鼠视网膜的VEGF和ICAM-1蛋白表达水平均得到了明显抑制[9],因此，CAPE可能通过抑制糖尿病状况下升高的NF-κB的转录活性减少VEGF和ICAM-1的表达，减轻炎症反应，从而对BRB起保护作用。

视网膜毛细血管周细胞具有微血管屏障、收缩血管、调节血容量、抑制内皮细胞增殖和限制新生血管扩展等作用，损伤后直接引发BRB的破坏。体内和体外实验表明视网膜周细胞凋亡依赖于NF-κB的激活[10]，NF-κB引发的视网膜周细胞凋亡是BRB破坏的重要原因。因此CAPE可能通过抑制NF-κB的转录活性抑制周细胞的凋亡，对BRB起保护作用。

高血糖诱导的代谢异常明显造成视网膜微血管病变，活性氧(reactive oxygen specie，ROS)和氧化应激被认为是高血糖和微血管病变之间的纽带[11]。ROS能使细胞膜和细胞质内的不饱和脂肪酸氧化，氧化产物产生的细胞毒作用能损伤视网膜毛细血管内皮细胞和基底膜，导致BRB的破坏和血液流变学的改变。CAPE结构中含有一对临位酚羟基，其中一个羟基供氢氧化成羰基之后易与另一个羟基形成稳定的分子内氢键，从而阻碍电子夺取链反应。因此，CAPE亦可能通过自身供氢氧化，中断各种原因引起的视网膜氧化应激损伤，对BRB起到保护作用。

[1]Joussen AM,Poulaki V,Le ML,et al.A central role for inflammation in the pathogenesis of diabetic retinopathy[J].Faseb,2004,8(12): 1450-1452

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[9]袁鹏,臧婵媛,周伟,等.咖啡酸苯乙酯对糖尿病大鼠视网膜VEGF和ICAM-1表达的影响[J].天津医药,2011,39(6):560-561

[10]Junghyun Kim,Chan-Sik Kim,Eunjin Sohn, et al.KIOM-79 protects AGE-induced retinal pericyte apoptosis via inhibition of NF-kappaB activation in vitro and in vivo[J].PLoS One,2012,7(8): e43591

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(2016-03-17收稿)(库雪飞编辑)

The effects of caffeic acid phenethyl ester on the blood-retinal barrier of diabetic rats

YUANPeng,LIUXuezheng

(BasicMedicalDepartmentofTianjinMedicalCollege,Tianjin300222,China)

ObjectiveTo observe the effects of caffeic acid phenethyl ester on the blood-retinal barrie of diabetic rats.MethodsDiabetic rats induced by streptozotocin were divided into three groups,diabetic group(DM),do not use any drugs;CAPE5 group,according to 5mg/kg,intraperitoneal injection of CAPE every 3 days；CAPE10 group,according to 10mg/kg,intraperitoneal injection of CAPE every 3 days；other rats were in normal control group(CON).3 months later,Using the Spectrophotometer colorimetric method to analysis the leakage of retinal tracer assessed by Evans Blue.ResultsThe amount leakage of evans blue in four groups were:CON group(11.62±3.35) ng/mg;DM group(54.31±4.89)ng/mg;CAPE5 group(29.65±3.88) ng/mg;CAPE10 group(26.51±4.05)ng/mg.The amount leakage of evans blue in DM group was 3.7 times higher than that in CON group (P<0.01);CAPE5 group and CAPE10 group retina evans blue leakage compared with the DM group were reduced by 45% (P<0.05) and 51% (P<0.05)，but there was no obvious difference between the CAPE5 group and CAPE10 group(P>0.05).ConclusionCaffeic acid phenethyl ester can protect the blood-retinal barrier of diabetic rats.

Diabetic retinopathy.Blood-retinal barrier.Caffeic acid phenethyl ester

袁鹏(1981-)，男，硕士研究生，讲师。研究方向：糖尿病视网膜病变。

刘学政。

R 587.1,R 774

A

2095-2694(2016)04-268-04